Электрофореграммы окрашивание

Таблица 5. Окрашивание электрофореграмм (по Ю. Киселевскому и соавт., 1999)

Различные методики окрашивания фиксированных нагреванием электрофореграмм позволяют не только выявить, но и количественно измерить различные белковые фракции. Кроме методик окрашивания белка, существуют также способы окрашивания липидных и углеводных компонентов липопротеидов и гликопротеидов. [c.54]

Нингидрин, 0,5%-ный раствор в ацетоне. Для окрашивания электрофореграмм применяют смесь из 95 частей этого раствора и 5 частей дистиллированной воды. [c.150]

Обработка агаровых пластинок. После окончания электрофореза ток выключают, предметные стекла с агаровым гелем тотчас извлекают из камеры и помещают на 30 мин в 5%-ный раствор СНзСООН. Каждую пластинку покрывают листочком фильтровальной бумаги, смоченным в 5%-ном растворе СНзСООН, для удаления воды и солей и высушивают при комнатной температуре в течение ночи. Для ускорения высушивания его проводят при температуре 37 °С или под струей теплого воздуха. Бумагу, приставшую к агаровой пленке, осторожно снимают, предварительно смочив ее водой. Перед окрашиванием агаровое поле должно быть совершенно сухим и прозрачным. Окрашивание белков на электрофореграммах проводят амидовым черным 10 Б в течение ночи. Не связавшийся с белком краситель отмывают 5%-ным раствором уксусной кислоты. Отмытые электрофореграммы высушивают при 37 °С. [c.93]

Окрашивание бумажных электрофореграмм. Разделенные при электрофорезе белковые фракции выявляют на бумажных полосках с помощью окрашивания амидовым черным. [c.48]

Возможность полного удаления не связывающегося с белком фуксина из бумаги является преимуществом этого метода, особенно удобного при количественном определении фракций с помощью элюирования (см. стр. 60). Одну и ту же порцию окрашивающего или дифференцирующего растворов можно использовать 4—5 раз. При первых отмывках новой серии электрофореграмм можно использовать последние порции отмывающего раствора из предыдущей процедуры окрашивания. [c.55]

Методика. Окрашивание продолжается 10 мин, затем электрофореграммы отмывают до полного удаления несвязавшегося красителя. [c.56]

МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ АГАРОВЫХ ЭЛЕКТРОФОРЕГРАММ [c.76]

Методика. Окрашивание продолжается 10 мин, затем электрофореграммы отмывают до полного удаления несвязавшегося красителя, каждые 15 мин меняя отмывающий раствор. [c.56]

Методика. Фиксированные нагреванием электрофореграммы на 18 ч погружают в окрашивающий раствор, нагретый до температуры 30° С, затем для удаления этанола в течение 2 мин промывают проточной водопроводной водой и высушивают при комнатной температуре. Окрашивание при температуре ниже 30° С приводит к выпадению красителя в осадок. Липопротеиды окрашиваются в красный цвет на розовом фоне. [c.57]

Увеличение прозрачности бумажной электрофореграммы. Окрашенные и высушенные электрофореграммы погружают в сосуд для окрашивания, заполненный глицерином. Необходимо следить [c.63]

ОКРАШИВАНИЕ АЦЕТАТ-ЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ ЭЛЕКТРОФОРЕГРАММ. [c.73]

Окрашивание электрофореграммы. В аналитическом варианте мотода высушенную электрофореграмму погружают в 0,5%-ный ацетон-нингидриновый или кадмий-нингидриновый раствор (см. стр. 192) и затем сушат 2—3 ч при 40—50°С. [c.99]

Методика диагонального электрофореза аналогична процедуре, проиллюстрированной на фиг. 22. Неполный гидролизат, содержащий пептиды с метионином, подвергают электрофорезу. После окрашивания контрольной полоски вырезают аналитическую электрофореграмму, смачивают ее 0,1 М раствором иодацетамида в пири-дин-ацетатном буферном растворе с pH 3,5 [пиридин—уксусная кислота—вода (1 10 90)]. Смачивание производят осторожно распылителем или пипеткой. Необходимо, чтобы бумага пропиталась полностью, но не содержала избытка влаги. Влажную полоску на 14—16 ч помещают в эксикатор при комнатной температуре, На дно эксикатора наливают буферный раствор pH 3,5 для создания соответствующей атмосферы. Необходимо следить, чтобы в эксикаторе части бумажной полоски не соприкасались друг с другом. После инкубации электрофореграмму высушивают на воздухе и избыток иодацетамида удаляют отмыванием в ацетоне, 3—4 раза погружая в него полоску. Сухую полоску пришивают к новому листу фильтровальной бумаги и подвергают электрофорезу, используя тот же самый буферный раствор, который применялся при первом электрофорезе, но проводя разделение под прямым углом к первоначальному направлению. Пептиды, содержащие метионин, благодаря изменению суммарного заряда на -]-1 единицу сместятся в сторону катода от диагонали, по которой располагаются другие пептиды. [c.109]

Окрашивание электрофореграммы. После окончания электрофореза бумажную полоску извлекают из прибора и фильтровальной бумагой удаляют избыток влаги с концов полоски. Для окрашивания электрофореграммы погружают на несколько секунд в раствор нингидрина, налитый в кювету надеть резиновые перчатки ). Затем электрофореграмму подвешивают на стеклянной рамке и подсушивают на воздухе в течение нескольких минут, после чего для проявления окраски полосу прогревают в темноте ) в сушильном шкафу или термостате при 60 °С в течение 15 мин. [c.151]

При нагревании его с а-аминокислотами возникает фиолетовое окрашивание различных оттенков. Нингидрин широко используется для проявления хроматограмм на бумаге и электрофореграмм а-аминокислот. [c.349]

Окрашивание продолжается 10 минут, после чего электрофореграмму промывают метиловым спиртом, содержащим 10% уксусной кислоты. [c.114]

Окрашивание продолжается 15 минут, затем электрофореграммы на 15 минут помещают для фиксации в метанол. Отмывание производят разбавленным в 3 раза метанолом, содержащим 1 % уксусной кислоты. [c.114]

Агар. Тщательно высушивают пластинку, погружают в реактив на 30 мин, а далее промывают трижды в свежих порциях растворителя (10 мин, 2 ч и 30 мин) [57]. Применение. Окрашивание пятен на электрофореграммах сыворотки. [c.222]

Визуализация макромолекул путем их окрашивания в методическом отношении представляет собой очень простую процедуру. Поддерживающую среду погружают на определенное время в ванну с раствором красящего вещества, после чего его избыток, не связавшийся с разделенными зонами макромолекул, удаляют. Электрофореграммы высушивают или хранят в соответст- [c.185]

Осаждение разделенных веществ проводят до их окрашивания или одновременно с ним путем погружения электрофореграммы в реактив для фиксации и окрашивания. [c.186]

Для окрашивания и фиксации электрофореграмм гели или другую поддерживающую среду обычно погружают в соответствующий раствор. Если нужно обработать одновременно несколько гелей, то их помещают либо в отдельные сосуды, например в пробирки (в опытах со столбиками полиакриламидного геля), либо в общую ванну, которая должна иметь отдельные отсеки для гелей, сообщающиеся между собой для обеспечения хорошего перемешивания раствора. [c.186]

Кумасси яркий синий можно применять для окрашивания электрофореграмм, полученных не только на пленках из ацетата целлюлозы, но и на других поддерживающих средах, таких, как фильтровальная бумага, агаровый и крахмальный гели [367] или полиакриламидный гель, [867]. К настоящему времени описано большое число, различных методов окрашивания белков этим реагентом после их электрофореза в полиакриламидном геле. [c.268]

Иногда требуется разрезать гель в продольном направлении, чтобы провести радиоавтографию или одновременное окрашивание электрофореграммы несколькими красителями. В литературе описаны аппараты для продольного разрезания как столбиков (рис. 74). [357], так и пластин [547] полиакриламидного геля. [c.204]

Электрофорез в первом направлении проводят обычным способом, а затем полученную электрофореграмму используют без фиксации и окрашивания в качестве стартовой зоны для электрофореза во втором направлении, перпендикулярном первому. Если оба этапа электрофореза осуществляют в идентичных условиях, то скорость миграции белков в обоих направлениях одинакова и зоны разделенных молекул располагаются по диагонали. Очевидно, что такие системы улучшают разделение лишь постольку, поскольку оно зависит от удлинения пути миграции разделяемых белков. Чтобы повысить разрешение в значительной степени, необходимо на втором этапе изменить по крайней мере один из электрофоретических параметров. В настоящей главе приводится краткое описание некоторых методов двухмерного электрофореза. Несколько дополнительных вариантов обсуждаются в главах, посвященных разделению определенных классов белков, в частности белков жидкостей тела, рибосомных и мембранных белков. [c.227]

Белки после электрофореза чаще всего выявляют, окрашивая электрофореграммы теми или иными красителями. Общие принципы методов окрашивания приведены в разд. 1.15.2, а здесь будут рассмотрены лишь некоторые белковые красители и отдельные примеры их применения. [c.266]

Окрашивание белков на электрофореграммах 267 [c.267]

Белки на бумажных электрофореграммах обычно фиксируют, высушивая последние при 100—120 °С, а затем бумагу погружают на 10 мин в ванночку с раствором, содержащем не более 1% красителя. Грассманн и Ханниг [468] предложили использовать насыщенный раствор амидового черного в смеси, состоящей из 9 частей метанола и 1 части уксусной кислоты. Обесцвечивание фона на электрофореграммах осуществляют, промывая их несколько раз той же смесью метанола и уксусной кислоты. Таким же способом обнаруживают белки и после электрофореза на ацетате целлюлозы, причем пленки можно сразу же погружать в раствор красителя для окрашивания вполне достаточно 5 мин. [c.266]

Работа состоит из следующих операций подготовка прибора и проведение электрофореза, окрашивание электрофореграммы, экстрагированне и фотометрировапие. [c.150]

Для обработки электрофореграмми можно использовать окрашивание или применить фотометрический метод. На рис. 5.5-2 изображено классическое разделение сывороточных белкон. [c.303]

Методика. Фиксированные электрофореграммы сворачивают, на 2—3 мин погружают в нагреваемый на водяной бане до кипения метанол, а затем 4 мин окрашивают раствором амидового черного, имеющим температуру ВО С. После окрашивания полоски расправляют на стекле, оставляют на 5 мин и затем промывают в отмывающем растворе, нагретом до 80°С, пока не удалят избыток красителя. [c.55]

Методика. I. Разрезание электрофореграммы на участки, занимаемые отдельными фракциями. На окрашенных и высушенных элек-трофореграммах те фракции, которые нужно элюировать, обводят карандашом. В местах, где граница между фракциями видна не четко, т. е. краситель не полностью удален из бумаги, соседние фракции делят по линии наименьшего окрашивания. [c.60]

Повторное разделение одного и того же материала дает разные результаты. Причина плохой воспроизводимости может заключаться в изменении условий опыта. Чтобы сделать условия опыта стандартными а) необходимо помнить, что фильтровальная бумага должна быть одного и того же типа б) необходимо стандартизовать факторы, влияющие на электрофорез (направление потоков буферного раствора, температура и т. п.) (см. стр. 52) в) краситель должен быть одним и тем же г) не следует менять способа количественной оценки электрофореграмм. При использовании метода элюирования мы советуем окрашивать белки кислым фуксином. Несвязавшаяся с белком часть этого красителя легко удаляется из бумаги, а связавшийся краситель затем легко элюируется. С другой стороны, при фотоэлектрометрии электрофореграмм очень удобно применять окрашивание амидовым черным 10В, так как он прочнее других красителей связывается с белками и примерно в 10 раз сильнее поглощает свет. Несмотря на то что при отмывании электрофореграмм амидовый черный невозможно полностью удалить из бумаги, фотоэлектрические измерения после окрашивания этим красителем достаточно точны. [c.66]

Электрофорез на ацетате целлюлозы служит простым и вместе с тем чувствительным способом обнаружения аномальных видов гемоглобина. Наиболее подходящей буферной системой является смесь трис-борная кислота-ЭДТА (pH 8,4) [816, 1141, 1224]. Для качественных анализов можно использовать микрометоды. Электрофореграммы анализируют либо без применения красителей, либо после их окрашивания общими белковыми красителями или с помощью пероксидазы. Последний метод, очевидно, более специфичен, так как выявляет только те белки, которые содержат гем. Шнейдер [1141] рекомендует двукратное окрашивание сначала пунцовым S, а затем раствором бензидина, содержащим нитропруссид натрия (дает синюю окраску). Если при электрофорезе необходимо определить содержание минорного (т. е. имеющегося в незначительном количестве) компонента, например гемоглобина Аг, то наиболее надежный метод состоит в том, что на пленку наносят относительно большое (точно определенное) количество образца, элюируют соответствующие зоны электрофореграммы без ее предварительного окрашивания и проводят фотометрическое измерение [1141]. При денситометрическом сканировании окра- [c.321]

После окрашивания электрофореграмм ацетон-нингидрино-вым раствором их необходимо зафиксировать. Для приготовления фиксатора смешивают 10 мл водного насыщенного раствора СиЫОэ, 0,2 мл азотной кислоты и 200 мл ацетона и полученную [c.99]

Выявление белков после ИЭФ. Как правило, белки выявляют теми же методами, которые применяются после обычного гель-электрофореза, а именно окрашиванием электрофореграмм специальными красителями, сканированием их в видимом ли ультрафиолетовом свете, преципитацией белков специфическими антигенами, а в случае фракций, обладающих ферментативной активностью, получением энзимограмм. [c.154]

Хранение бумажных электрофореграмм и полосок ацетата целлюлозы после их соответствующего окрашивания, обесцвечивания и фиксации не представляет трудностей. Пластины агарового геля после высушивания превращаются в тонкие пленки и тоже хорошо хранятся. Сохранение же пластин крахмальных и полиакриламидных гелей более обременительно. Лучше всего их держать в закрытых сосудах под слоем жидкости, обычно разбавленной уксусной кислоты. Но такие контей- [c.194]

Другой способ количественного определения белков основан нэ элюции красителя из белковых зон после окрашивания и обесцвгечивания электрофореграмм в стандартных условиях. Феннер и др. [374] рашивали гели 0,5%-ным раствором кумасси яркого синего R-250 в 50%-ном водном метаноле, содержавшем 7,5% уксусной кислоты, по методу, который предложили Бикл и Траут [119]. После обесцвечивания фона окрашенные зоны вырезали и краситель экстрагировали из кусочков геля 25%-ным водный пиридином (объем/объем), встряхивая их при комнатной температуре до тех пор, пока не наступало равновесие, что определяли путем повторных измерений поглощения раствора. Пиридин смещает максимум поглощения красителя с 550 до 605 нм, поэтому измерение поглощения проводили при 605 нм. Этот метод позволяет определять белки в пределах 1 — 100 мкг. Он особенно полезен при двухмерном электрофорезе на пластинах геля, поскольку их сканирование представляет в настоящее время определенные технические трудности. [c.270]

Кумасси яркий синий G-250 (ксилоловый яркий цианин G, С. I. 42 665) по своей структуре сходен с кумасси ярким синим R-250, но содержит две дополнительные метильные группы. Ди-зел и др., [302] предложили использовать его для окрашивания белков в полиакриламидном геле. Гели погружают на 5 мин в. 12,5%-ную ТХУ, затем к 40 мл этого фиксатора добавляют 2 мл 0,25 уЬ-ного (масса/объем) водного раствора кумасси яркого синего G-250 и тщательно все перемешивают. С помощью данного метода белковые полосы хорошо прокрашиваются, и уже через 30 мин после электрофореза электрофореграммы можно фотографировать, не проводя их обесцвечивания, поскольку этот краситель еще менее, чем R-250, растворим в воде и почти не проникает в гель. При хранении гелей в 5%-ной уксусной кислоте интенсивность окраски белковых зон значительно увеличивается, по всей вероятности, вследствие диффузии красителя внутрь белковой зоны. Гели можно хранить в течение 8—10 нед без существенного снижения интенсивности окраски. [c.270]

Для окрашивания белков после электрофореза на бумаге можно использовать азокармин В по методике, описанной для амидового черного 10 В. Полоски электрофореграмм помещают на 10 мин в раствор азокармина В в смеси 90%-ного метанола и 10%-ной уксусной кислоты. Фон обесцвечивают той же смесью растворителей [711]. Белки в агаровом геле окрашивают 0,05%-ным раствором азокармина в смеси, состоящей из 20 мл ледяной уксусной кислоты, 150 мл глицерина и 830 мл воды [1329]. [c.272]

Окрашивание белков быстрым зеленым F F (пищевой зеленый 3, .I. 42053), по-видимому, имеет преимущества при их количественной денситометрии в полиакриламидном геле [453]. Гели погружают на 2 ч в раствор, содержащий 1% (масса/ объем) быстрого зеленого в 7% -ной уксусной кислоте. Обесцвечивание фона проводят путем повторных промываний электрофореграмм 7%-ной уксусной кислотой. Для цилиндрических гелей диаметром 6 мм линейная зависимость между площадью пика на денситограмме и количеством нанесенного белка сохраняется вплоть до 150—200 мкг. Показано, что по своей чувствительности данный метод сравним с методами, основанными на использовании амидового черного. Он позволяет обнаруживать 1—3 мкг белка в одной полосе. Быстрый зеленый пригоден для количественного определения гистонов после их электрофореза в полиакриламидном геле [856]. [c.273]

Как уже отмечалось, фосфатазную активность можно обнаружить с помощью реакции азосочетания. С этой целью часто используют метод одновременного сочетания. Электрофореграммы инкубируют 15 мин при 25 С в растворе, содержащем 25 мМ нафтилфосфат, 1 мг/мл соли прочного красного ТК (диазотиро-ванный 2-амино-5-хлортолуол, ЕпСЬ) и 33 мМ буфер трис-НС1 [15, 16]. После окрашивания гели промывают водой для удаления избытка красителя. Субстратами для щелочных фосфа-таз могут служит как а-, так и -иафтилфосфаты. При использовании реакционной смеси, содержавшей 3,74 г/л борной кислоты, 2,04 г/л МдСЬ бНаО, 1 мг/мл соли прочного синего ВВ и один из нафтилфосфатов (pH доводят с помощью КОН до 9,7), [c.298]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология