связывание с олигонуклеотидами

Рис. 6.13. Связывание олигонуклеотидов с помощью ферментов.

Изучение ассоциации олигонуклеотидов показало, что наиболее благоприятно для биологической функции спаривание триплетов. Дублеты обладают слишком низкими значениями К, квартеты дают, напротив, слишком сильное связывание. Время жизни пары кодон — антикодон не должно превышать нескольких миллисекунд, так как в противном случае оно будет лимитировать скорость работы биосинтетической системы. [c.266]

Влияние синтетических олигонуклеотидов (со средней длиной цепи около б нуклеотидов) на спектры поглощения розанилина, толуидинового голубого и акридинового оранжевого (рис. 8-3 и 8-4) [21, 22] было сходным, но не идентичным тому, которое наблюдалось при использовании нуклеиновых кислот. Чтобы избежать связывания с отдельными мономерными фрагментами, которое, по-видимому, могло произойти при большом избытке полимера, использовали эквимолярные количества красителя и полинуклеотида [56[. Кроме того, применяли буферные растворы с низкой ионной силой, так как при избытке катионов, особенно двухвалентных, константы связывания для комплексов краситель — нуклеиновая кислота понижены. (Двухвалентные катионы примерно в 30 раз эффективнее одновалентных и, по-видимому, действуют исключительно как [c.529]

Если повышение температуры вызывает главным образом плавление и увеличение степени связывания длинных олигонуклеотидов, то в случае более коротких олигонуклеотидов этот эффект должен быть меньше. Последнее должно расширить возможность дифференциации олигонуклеотидов по длине цепи. [c.54]

Как известно, функция рибонуклеазы состоит в гидролитическом расщеплении рибонуклеиновых кислот и олигонуклеотидов. Как мы видели, это один из первых белков, изучавшихся с помощью ЯМР, хотя спектры, полученные на ранних стадиях, не обнаруживали характерных деталей. Рибонуклеаза близка по размеру (молекулярная масса 13700, 124 аминокислотных остатка) и форме к лизоциму и является удобным объектом для изучения методом ЯМР. В ее молекуле имеются 4 дисульфидных мостика, 18 остатков основных аминокислот (10 Лиз, 4 Apr и 4 Гис) и только 10 остатков кислых аминокислот (5 Глу и 5 Асп). Таким образом, в растворе при нейтральных pH молекула заряжена положительно. По сравнению с лизоцимом она содержит несколько меньше а-спиральных структур и больше -структур (остатки 42—49, 71—92 и 94—110). В дополнение к 4 Гис имеются также 6 Тир и 3 Фен, но нет остатков триптофана. Полная трехмерная структура рибонуклеазы известна из рентгеноструктурных исследований, проведенных двумя группами авторов [37, 38, 38а]. Форма ее глобулы близка к сферической имеется большая щель, в которой происходит связывание субстрата. С одной стороны этой щели расположены в непосредственной близости друг от друга остатки Гис-12, Гис-119 и Лиз-7, а с другой стороны находится Лиз-41. По данным подробных химических исследований все эти четыре остатка входят в активный центр. [c.363]

На каждом этапе колоночной хроматографии содержание белка в смеси увеличивается не более, чем в 20 раз. и поэтому выделить из сложной смеси белков отдельный белок за один цикл практически невозможно. На долю каждого белка, как правило, приходится менее 1/1000 всего белка клетки, и для его очистки требуется последовательное использование нескольких различных типов колонок (рис. 4-47). Гораздо более эффективен метод аффинной хроматографии (хроматография но сродству). В основе этого метода лежат биологически важные взаимодействия, происходящие на поверхности белковых молекул. Так, при ковалентном связывании субстрата фермента с матриксом, например, с полисахаридными шариками, фермент специфически удерживается матриксом и может быть элюирован (смыт) практически в чистом виде. Подобным образом можно иммобилизировать короткие олигонуклеотиды ДНК определенной структуры (см. разд. 4.6.8) и использовать подобные носители для очистки ДНК-связывающих белков, опознающих данную последовательность нуклеотидов на хромосомах (см. разд. 9.1.8). С матриксом можно связать и специфические антитела такой носитель очень удобен для очистки белков, узнаваемых этими антителами. Аффинные колонки обладают высокой степенью специфичности за один цикл хроматографии можно добиться очень высокой степени очистки (1000-10000 раз). [c.213]

Метод анализа кривых элюирования применен в колоночной хроматографии олигоадениловой кислоты на агарозе со связанной полиуридиловой кислотой при нескольких температурах и концентрациях олигоадениловой кислоты. Теория кооперативного связывания олигонуклеотидов с полинуклеотидом была расширена таким образом, что эта хроматографическая система может быть описана теорией теоретических тарелок, как упоминалось в разд. 3.2. [c.55]

На рис. 6.13 показан процесс последовательного связывания олигонуклеотидов с использованием ферментов. Получаемый на первом этапе эйкозануклеотид СОСООООиОСАССАОС (соответствующий первым двадцати звеньям тРНК ") является в настоящее время пределом возможностей искусственного синтеза РНК (Икехара, 1979). [c.189]

РЕЗУЛЬТАТЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ ПРИ ИЗУЧЕНИИ СВЯЗЫВАНИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С тРНК [c.422]

Мы можем получитБ дополнительные сведения, изучая конкурентное связывание олигонуклеотидов. Допустим, например, что мы добавили слабо связывающийся и не содержащий радиоактивной метки тример в количестве, значительном по сравнению с присутствующей в растворе тРНК, которая тем не менее имеется в избытке по сравнению с меченым олигонуклеотидом. Тогда присутствие конкурирующих молекул проявится в том, что они образуют комплекс с частью тРНК, величина которой зависит от их константы связывания [c.425]

Отметим, что анионообменники с ионогеннымн группами двух последних типов разработаны для специальных целей. Так, радикалы PEI предназначены для связывания полианионов регулярного цепочечного строения, например олигонуклеотидов, а РАБ — для ковалентного присоединения белков и НК с помощью реакции диазотирования (для аффинной хроматографии). [c.252]

Особый интерес представляют, конечно, взаимодействия рибосомных белков с высокополимерными рибосомными РНК (16S и 23S РНК прокариот или 18S и 28S РНК эукариот), ибо они представляют собой основной ковалентный каркас и структурное ядро рибосомных субчастиц. По-видимому, больщинство рибосомных белков контактируют и так или иначе взаимодействуют с высокополимерными рибосомными РНК. Однако среди них можно выделить специальные сердцевинные РНК-связывающие белки, которые прочно взаимодействуют с соответствующей рибосомной РНК, более или менее независимо от других белков. Такими белками малой (30S) рибосомной субчастицы Е. соИ, независимо вступающими в комплекс с 16S РНК, являются S4, S7, S8, S15, S17 и S20. Каждый из них связывается только со специфическим местом на 16S РНК, узнавая его нуклеотидную последовательность и пространственную структуру. Эту последовательность можно выявить таким путем изолированный белок добавляется к рибосомной РНК, в результате чего образуется специфический белок-РНК-комплекс комплекс переваривается рибонуклеазой, так что негидролизованной остается лищь та часть нуклеотидной последовательности, которая закрыта белком эта защищенная последовательность определяется и, таким образом, идентифицируется. Другой метод локализации белков на первичной структуре рибосомной РНК — ковалентная сщивка (например, фотоиндуци-рованная) белка с РНК непосредственно в составе рибосомы, с последующим удалением несшитых белков, перевариванием РНК с помощью РНКазы и идентификацией сшитого олигонуклеотида. Расположение мест связывания вышеуказанных шести белков вдоль цепи 16S РНК схематически показано на рис. 59, а. Видно, что белки [c.100]

Данный метод предполагает, что за антигенсвязываюшую способность антитела отвечают только DR-участки, а не каркасные области. Однако, если связывание гибридного антитела с антигеном происходит недостаточно эффективно, может возникнуть необходимость в замене некоторых аминокислот в каркасных областях с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза. [c.217]

Синтезированы антисмысловые олигонуклеотиды с фосфорамидитной и полиамидной (пептидной) связями (рис. 21.14, Вм Г). Такие молекулы очень устойчивы к действию нуклеаз. Химические группы, присоединенные к 2 -угле-родному атому сахарного остатка и С-5-атому пиримидинов, также защищают антисмысловые олигонуклеотиды и облегчают их связывание с сайтом-мишенью (рис. 1.14, Ди ). Все преимущества этих и других модификаций сейчас интенсивно изучаются. [c.506]

РНК-лигаза катализирует ковалентное связывание одноцепочечных ДНК или РНК, при условии, что они содержат концевые З -ОН- и 5 -Р0<,-группы. Молекулы, содержащие З -ОН-группы, принято называть акцепторными, а 5 -Р04—донорными. В роли доноров выступают олигонуклеотиды и двухцепочечные ДНК. Минимальными донорами могут быть нуклеозид 3, 5 -дифос-фаты pNp и pdNp. Полирибонуклеотиды более эффективны в качестве акцепторов, чем полидезоксирибонуклеотиды. Трииуклеозид-дифосфаты NpNpN—ОН являются минимальными акцепторами. Эта реакция лигирования иллюстрируется схемой. [c.353]

Расчеты показывают, что для специфичного связывания с геном в геноме, иап(жмер для бактериофага >., достаточна длина 12 нуклеотидных звеньев, последовательность 15 звеньев идентифицирует уникальный ген в дрожжевом геноме, а 18—20-членные олигонуклеотиды используют для поиска генов в банке генов млекопитающих. [c.379]

Описан родственный метод, основанный на образовании специфического комплекса с молекулами, имеющими относительно короткие цепи [563]. Этерификацией гидроксильных групп целлюлозы концевыми 5 -фосфатными остатками смеси политимидиловых кислот с небольшой длиной цепи при помощи дициклогексилкарбодиимида было достигнуто ковалентное связывание этих олигонуклеотидов с целлюлозой. При 4° гекса(дезоксиадениловая кислота) удерживалась колонкой и, таким образом, могла быть отделена от гекса(тимидиловой кислоты) олигоадениловая кислота элюировалась при 35°. Этим методом возможно фракционирование транспортных РНК [563]. [c.371]

При изучении влияния олигонуклеотидов на спектры поглощения ряда красителей в видимой области было получено доказательство, подтверждающее тот факт, что плоскости пуриновых и пиримидиновых оснований в этих полимерах расположены друг над другом. Широко изучено связывание нуклеиновыми кислотами некоторых плоскостных основных красителей и аминоакридинов [35— 51]. Основные красители, проявляющие метахроматизм при взаимодействии с полиэлектролитами, характеризуются тем, что их водные растворы не подчиняются закону Ламберта — Бера. Это отклонение обусловлено агрегацией молекул красителя в концентрированных растворах. Долгое время считали, что агрегация происходит за счет того, что молекулы ароматического соединения укладываются друг над другом так, что их плоскости параллельны, причем нити агрегатов удерживаются вместе за счет лондоновских дисперсионных сил, возникающих между я-электронными системами, вследствие чего появляются изменения в спектре поглощения в видимой области. Связывание таких красителей нуклеиновыми кислотами в разбавленном растворе приводит к аналогичным эффектам (рис. 8-2). Прямая корреляция метахроматичности красителей (за счет определенной упаковки молекул) с гипохромизмом олигонуклеотидов вытекает из тех наблюдений [52, 53], которые показывают, что силы, действующие между циклами соседних ионов в агрегатах красителей в концентрированных растворах, характеризуются равновесным расстоянием 3—4 А. Отрицательный дихроизм окрашенных волокон ДНК (при использовании толуидинового голубого) в видимой области указывает на то, что в таких случаях плоскостные поглощающие группировки красителя расположены в основном под [c.528]

В некоторых опытах смесь фрагментов гидролизовали Т - и панкреатической РНК-азами и затем устанавливали структуру самых крупных продуктов гидролиза стандартным фингерпринтированием. Несмотря на то что относительные выходы защищенных участков РНК от опыта к опыту несколько изменялись, в общем между опытами по связыванию наблюдалось соответствие и образующийся набор олигонуклеотидов оказывался одним и тем же независимо от того, использовалась ли для расщепления комплекса Т - или панкреатическая РНК-аза. В результате информации, полученной при анализе продуктов частичного Т i -РНК-азного гидролиза экранированных участков, многие из этих олигонуклеотидов можно было расположить в виде перекрывающихся последовательностей. Это позволило заключить, что исходному набору олигонуклеотидов отвечает несколько дискретных длинноцепочечных последовательностей. Одна из них, очевидно, включает стартовый участок цистрона белка оболочки, поскольку она содержит последовательность [c.175]

Рисунок 21. Определения малых количеств человеческой ДНК методом гибридизации биотинилированного олигонуклеотида с образцами иммобилизованной ДНК. Визуализация образовавшегося ассоциаты происходит путем связывания с биотином конъюгата Пероксидазы хрена со Стрептавидином и дальнейшего окисления хромогена ТМВ.

Очень полезно, а иногда и просто необходимо иметь рестрикционную карту такой клонированной вставки ДНК. Расположение сайтов рестрикции, особенно тех, что встречаются лишь 1—2 раза во всей плазмиде, можно определить при помощи стандартных методик рестрикционного картирования [24]. Для обоих типов одноцепочечных зондов необходимо иметь единичный сайт рестрикции в участке тестируемой ДНК, дистальном по отношению к сайту связывания с РНК-полимеразой в случае РНК-зондов (см. разд. 5.1) или с олигонуклеотидами в случае ДНК-зондов (см. разд. 6.3 и рис. 10). После реассоциации одноцепочечного меченого ДНК-зонда с тестируемой ДНК может возникнуть необходимость расщепить гибридную последовательность ДНК на 2—3 фрагмента с оптимальной для ДГГЭ длиной. В этом случае надо использовать сайты рестрикции, имеющиеся в тестируемом фрагменте. [c.141]

Смотреть страницы где упоминается термин связывание с олигонуклеотидами: [c.529] [c.422] [c.423] [c.286] [c.373] [c.230] [c.425] [c.80] [c.507] [c.173] [c.318] [c.276] [c.528] [c.41] [c.423] [c.536] [c.537] [c.82] [c.54] [c.273] [c.190] [c.194]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология