Гибридные антибиотики

Возможность клонировать все гены путей биосинтеза определенных антибиотиков позволила реализовать в 1985 г. давнюю мечту исследователей — создавать гибридные пути биосинтеза новых антибиотиков за счет совмещения и взаимодействия ферментов, кодируемых разными видами стрептомицетов. Образуемые при этом новые антибиотики принято называть гибридными антибиотиками. [c.278]

Векторные плазмиды и векторные вирусы со встроенными чужеродными генами часто называют гибридными (шти химерными) плазмидами (или фагами). После конструирования рекомбинантных ДНК их с помощью трансформации вводят в реципиентный организм бактериальную, грибную, растительную или животную клетку. Трансформация предусматривает предварительную обработку клеток соединениями, обусловливающими проникновение ДНК внутрь клеток с последующим их помещением в среду, в которой способны существовать только клетки, получившие векторную молекулу, например в среду с определенным антибиотиком. [c.120]

Для отбора клеток, содержащих рекомбинантную ДНК, используют специальные приемы. Чтобы уменьшить количество кольцевых плазмидных молекул, образующихся ири сшивании фрагментов ДНК-лигазой Т4, рестрицированную плазмидную ДНК обрабатывают щелочной фосфатазой, удаляющей 5 -концевые фосфатные группы. Для отбора трансформированных клеток, содержащих гибридные плазмиды, проводят 1) тестирование на резистентность к определенным антибиотикам или колориметрическую реакцию 2) иммунологические тесты или выявление специфического белка - продукта клонированного гена 3) гибридизацию с зондом, комплементарным како-му-либо участку искомого гена. [c.78]

Многие плазмиды несут гены, обусловливающие устойчивость к антибиотикам. Это оказывается полезным при создании клонирующих систем. Обычно используют плазмиду, несущую два гена, обеспечивающих устойчивость к разным антибиотикам. Один из них служит просто для идентификации бактерий, несущих плазмиду, путем отбора клеток, устойчивых к антибиотику. Другой служит для того, чтобы отличить гибридную плазмиду от родительского вектора. Если сайт встраивания чужеродной ДНК находится внутри такого гена, гибридная плазмида теряет устойчивость к антибиотику. Таким образом, селекция родительского вектора может производиться по признаку устойчивости к двум антибиотикам, в то время как отбор гибридной плазмиды может основываться на сохранении устойчивости к одному антибиотику и чувствительности-к другому. [c.237]

Адаптация генно-инженерных методов к этим видам микроорганизмов затруднена в связи с отсутствием удобных векторных молекул и способов введения в клетки коринебактерий чужеродной ДНК. Плазмиды обнаружены у многих коринебактерий, но все они оказались криптическими. До настоящего времени не удалось использовать ни один репликон других бактерий для создания векторов у коринебактерий. Имеющиеся векторы представляют собой гибридные молекулы, содержащие репликон криптической плазмиды коринебактерии и гены, кодирующие устойчивость к антибиотикам из плазмид других бактерий (табл. 5). Сложность конструирования таких векторов связана не только с трудностью идентификации криптических плазмид, но и с тем, что внедрение селективных маркеров производится наугад, так как не известно строение репликона этих плазмид. [c.174]

Первичный отбор гибридных клонов значительно упрощается, если в векторной молекуле предусмотрена специальная фенотипическая система селекции. При трансформации клеток чаще всего используют векторные молекулы ДНК, несущие гены устойчивости к антибиотикам и антиметаболитам. Поэтому на среде с определенным антибиотиком или антиметаболитом будут расти только клетки трансформантов. Особенно хорошо данная система селекции отработана для бактерий, так как получены векторные плазмиды, детерминирующие устойчивость трансформированных клеток сразу к нескольким антибиотикам. Если векторная плазмида определяет устойчивость к двум антибиотикам и при встройке в нее экзогенного фрагмента ДНК нарушается одна из генетических детерминант устойчивости к антибиотикам, то клоны клеток, содержащих такие гибридные ДНК, легко отличить от трансформантов, включающих исходный вектор, на средах с каждым антибиотиком в отдельности. [c.34]

Рассмотренные плазмиды — векторы с негативной селекцией, так как гибридные молекулы ДНК выявляются по инактивации определенных генов устойчивости к антибиотикам. Первоначально на агаризованной селективной среде с определенным антибиотиком отбирают клоны клеток, содержащих или гибридные, или исходную плазмиды, а лишь затем перепечаткой на среду с антибиотиком, ген устойчивости к которому в гибридных плазмидах должен быть нарушен, выявляют клоны гибридов. [c.243]

Несомненно, Streptomy es для генетической инженерии наиболее интересны как продуценты антибиотиков, и особенно гибридных антибиотиков. Однако эти бактерии в ряде сл) аев могут быть полезны и как хозяева при создании штаммов, продуцирующих целевые белки. Например, можно попытаться создать штамм стрептомицетов, который кроме набора антибиотиков будет синтезировать и секретировать из клеток биологически активный полипептид типа интерферона или интерлейкина. Возможно, полученный на базе такого штамма комплексный препарат будет полезен для ветеринарии и/или медицины. [c.279]

На втором этапе проводят разделение этих двух вариантов. Клетки, выросшие на среде с ампициллином, переносят на среду с тетрациклином методом перепечатки. Клетки, образующие колонии на чашках с тетрациклином, содержат интактную плазмиду рВК322, поскольку, как мы уже говорили, они устойчивы и к ампициллину, и к тетрациклину. Клетки, не выросшие на чашках с тетрациклином, чувствительны к этому антибиотику, значит, они содержат гибридную плазмиду рВК322. [c.60]

Оказавшись в бактериальной клетке, линейная молекула pLFR-5 со вставкой замыкается в кольцо благодаря спариванию os-сайтов. В такой стабильной конфигурации она может долгое время существовать в клетке и реплицироваться как гибридная плазмида, поскольку содержит все необходимые для этого элементы. Более того, ген устойчивости к тетрациклину обеспечивает рост колоний, несущих данную космиду, на среде с этим антибиотиком нетрансформированные клетки при этом погибают. Существуют и другие космидные векторы на основе фага X. [c.76]

При этом имеется в виду, что потомство от скрещивания самок и самцов различных популяций одного вида остается стерильным. Подобное явление наблюдали и в недавних исследованиях вида Aedes s utellaris. В соответствии с моделью Файна [139], в этих случаях возникает несовместимость инфицированных спермиев и не-инфицированных яиц, все другие комбинации должны быть совместимыми. Значительно сложнее взаимоотношения между различными популяциями комаров, в которых присутствуют несовместимые эндемичные штаммы Wolba hia. Если при применении антибиотика (тетрациклин) риккетсии погибают, явление гибридной стерилизации исчезает. (Об использовании гибридной стерилизации, или несовместимости, для борьбы с насекомыми см. раздел 8.3). [c.186]

Альтернативные методы скрининга космидных библиотек, описанные в гл. 3, предполагают селекцию космидных клонов с использованием феномена гомологичной рекомбинации in vivo. Остальные главы книги посвящены вопросам, связанным с экспрессией клонированных генов. Для многих белков млекопитающих удалось осуществить высокопродуктивную внутриклеточную экспрессию в Е. oli. Однако гетерологические белки, локализующиеся в цитоплазме, часто образуют трудно растворимые агрегаты, что значительно осложняет получение нативного продукта. В гл. 4 описаны эффективные способы выделения активных растворимых продуктов из нерастворимых белков цитоплазмы Е. соИ. Вероятность деградации специфическими бактериальными протеиназами многих эукариотических белков, синтезируемых в Е. oli, может быть существенно снижена, если их экспрессировать в виде гибридных белков. Такие составные белки, в которых бактериальный компонент обычно представлен -галактозидазой, можно использовать в качестве иммуногенов для получения антисыворотки и моноклональных антител к клонированному эукариотическому белковому домену. Эти вопросы >ассматриваются в двух главах — одна посвящена получению поликлональной антисыворотки, а другая — методам гибридной технологии. В последующих главах книги описаны современные эукариотические экспрессирующие системы в гл. 7 — дрожжевая, далее в трех главах — системы на основе культивируемых клеток млекопитающих и трансгенные животные. В частности, описана система экспрессии с использованием векторов, которые несут гены, обеспечивающие возможность их индуцибельной амплификации это позволяет снимать токсическое действие антибиотиков, введенных в культуральную среду. Клонированные в таком векторе гены также [c.8]

С появлением методологии генной инженерии метод локализованного мутагенеза становится доступным для широкого круга микроорганизмов. В наиболее простом варианте клонированный фрагмент ДНК, ограниченный удобными сайтами рестрикции, может быть выделен и подвергнут мутагенезу in vitro. Вследствие проведения реакции in vitro дозы мутагена могут быть достаточно высокими, что сильно повышает частоту мутагенеза. Такой подход использован при создании штамма-продуцента гомосерина (см. гл. 4). Для получения стабильных неревер-тирующих мутаций в определенном гене можно применить метод инсерционного локализованного мутагенеза. С этой целью инактивируемый ген клонируют на плазмиде и встраивают в него детерминант устойчивости к антибиотику (рис. 29). Затем компетентные клетки трансформируют сконструированной гибридной плазмидой (или полученной при ее расщеплении линейной молекулой ДНК), содержащей указанный детерминант, фланкированный последовательностями, гомологичными хромосомному гену. В результате двойного кроссинговера происходит интеграция гена лекарственной устойчивости в гомологичный район хромосомы. Искомые трансформанты отбирают на селективных [c.160]

Для идентификации бактерий иногда используют также метод ДНК-зондов (генных зондов), являющийся разновидностью метода молекулярной гибридизации ДНК—ДНК. Реакция гибридизации ведется в этом случае не между двумя препаратами тотальной ДНК, а между фрагментом нуклеотидной последовательности ДНК (зондом), включающим ген (генетический маркер), ответственный за какую-то определенную функцию (например, устойчивость к какому-нибудь антибиотику), и ДНК изучаемой бактерии. Самым распространенным способом создания генных зондов является выделение специфических фрагментов путем молекулярного клонирования. Для этого вначале создают банк генов изучаемой бактерии расщеплением ее ДНК эндонуклеазами рестрикции, а затем отбирают нужный клон из суммы фрагментов ДНК методом электрофореза с последующей проверкой генетических свойств этих фрагментов методом трансформации. Далее выбранный фрагмент ДНК с помощью фермента лигазы вводят в состав подходящей плазмиды (вектора), а эту комбинированную-плазмиду вводят в удобный для работы штамм бактерий (например, Es heri hia соН). Из биомассы бактерии, несущей ДНК-зонд, выделяют плазмидную ДНК и метят ее, например, радиоизотопной меткой. Затем осуществляют гибридизацию ДНК зонда с ДНК бактерии. Образовавшиеся гибридные участки проявляют методом ауторадиографии. По относительной частоте гибридизации генетического маркера с хромосомой той или иной бактерии делают заключение о генетическом родстве этих бактерий с исследуемым штаммом. [c.197]

Е. соИ с Тс на Тс ". Во многом аналогично сконструированы плазмиды Е. соИ, содержащие ген хлорамфениколацетилтрансферазы ( at), у которого делетирован промотор, но сохранена структурная часть. Эти плазмиды также обеспечивают возможность клонирования последовательностей ДНК, которые в клетках Е. соИ функционируют как промоторы. По степени устойчивости к антибиотику, детерминируемой гибридными промоторсодержащими плазмидами, можно осуществлять косвенную оценку эффективности функционирования отобранных промоторов. [c.97]

Кроме векторов — производных фага М13 получен ряд векторов на основе фагов fd и fl. На рис. 2.32 приведена структура нескольких векторных вариантов фага fd, которые были сконструированы по стратегии, разработанной при получении фага М13тр1. В данном случае векторные фаги обусловливают устойчивость к антибиотикам, и поэтому инфицированные ими клетки способны расти на питательной среде с соответствующим антибиотиком. При этом клоны клеток Е. oli, инфицированных (трансфицированных) гибридными фагами, легко выявляются на селективных средах. [c.117]

Стабилизировать наследование гибридных плазмид в клетках Е. oli часто удается, выращивая их в условиях селективного давления по плазмидным маркерам устойчивости к антибиотикам, т. е. в присутствии определенных антибиотиков. При культивировании плазмидосодержащих штаммов в больших объемах такой подход уже малоприемлем вследствие дефицитности антибиотиков и их невысокой стабильности. Более технологичными являются подходы, основанные на автоселекции клеток, содержащих гибридные плазмиды. [c.207]

Из изученных плазмид лишь pUBllO и ее гибридные производные характеризуются достаточно высокой стабильностью в клетках бацилл. При культивировании плазмидосодержащих щтаммов на питательных средах без антибиотиков заметная потеря клетками плазмид наблюдается только в постэкспоненциальной и стационарной фазах роста культуры, что обычно мало сказывается на продуктивности штаммов по целевому белку Большое значение для стабильного поддержания гибридных плазмид в клетках бацилл имеет состав питательной среды и условия культивирования. Поэтому при создании технологических процессов на основе штаммов-продуцентов, конструируемых методами генетической инженерии, необходимо уделять пристальное внимание выбору оптимальных условий культивирования. [c.268]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология