Методы клеточной иммобилизации

МЕТОДЫ КЛЕТОЧНОЙ ИММОБИЛИЗАЦИИ [c.169]

Своеобразие рассматриваемых процессов состоит также в том, что. конечный продукт, находящийся первоначально в очень сложной смеси растворенных в воде веществ, должен быть получен со степенью чистоты, определяемой его последующим применением, т. е. с чистотой фармакопейных препаратов. Такая задача была бы крайне трудной, если бы не возможность использования специфических антител. Действительно, промышленное производство моноклональных антител из культур клеток, полученных методами клеточной инженерии (гибридомная техника), оказалось тем биотехнологическим производством, которое дало гигантский эффект в методах выделения особо чистых биопрепаратов. Иммобилизация моноклональных антител,. специфическим антигеном которых является, например, аг-интерферон, позволяет выделять последний в чистом виде из жидких смесей любого состава, пропуская их через колонку, в которой целевой продукт задерживается на твердом носителе, несущем антитело, а все остальные компоненты раствора, не дающие реакции антиген—антитело , проходят неизменными. После промывки комплекс интерферона с антителом легко разрушается и продукт получается в чистом виде. [c.28]

Все известные методы иммобилизации принято разделять на физические и химические. Из методов первой группы наиболее щироко применяются адсорбция на нерастворимых носителях и включение в структуру геля. Они особенно эффективны при разработке новых перевязочных материалов, мазей и кремов различной направленности действия. Метод иммобилизации ферментов в полупроницаемые оболочки часто называют методом микрокапсулирования, механизм которого заключается в фиксировании водных растворов ферментов в замкнутых сферических коацерватах, имеющих тонкую полимерную оболочку, способную удерживать изнутри высокомолекулярный субстрат и в то же время дающую возможность свободно диффундировать через нее низкомолекулярному. Это позволяет сохранить фермент одновременно в нативном и в иммобилизованном состоянии, многократно вводить и выводить его из реакционной смеси [34, 35]. Представляет интерес метод включения ферментов в липосомы, которые имеют большие возможности применения в медицине, так как по своему составу приближаются к клеточным мембранам [36]. [c.206]

Необходимо различать методы иммобилизации, в результате которых клетки становятся неподвижными при естественном росте на предоставленной подходящей поверхности, и те, при которых выращенная клеточная популяция активно обрабатывается для достижения иммобилизации. Активные методы более широко распространены и могут быть использованы для клеток в любом физиологическом состоянии. Естественные методики, в общем, более доступны и дешевы, так как не требуют никаких дополнительных затрат. Мы рассмотрим наиболее широко распространенные методы, разделенные на четыре указанные выше группы (рис. 5.2). [c.169]

Анализ литературных и патентных данных, посвященных флокуляции объектов биологической природы, показывает неуклонную тенденцию роста научного и практического интереса в этой области знаний. Так, если в 50-60-е годы они были связаны исключительно с концентрированием суспензий микроорганизмов и вирусов, то к настоящему времени область практического применения флокулянтов существенно расширилась. Основные отрасли, в которых метод флокуляции находит практическое применение, это — микробиологическая, медицинская, пищевая промьппленность и водоочистка. Важнейшие направления исследований и практического применения флокулянтов концентрирование биомассы, очистка культуральных жидкостей и питательных сред от клеточного материала и других примесей, очистка и концентрирование растворов ферментов, антибиотиков, других продуктов микробного синтеза, иммобилизация клеток и ферментов, очистка сточных вод (см. схему на рис. 6.1). [c.117]

Ковалентное присоединение микроорганизмов к носителям начали применять позднее других методов вследствие токсичности используемых реагентов, например, глутарового и других альдегидов, цианурхлорида и др. Рассматриваемый метод иммобилизации основан на образовании ковалентных связей молекул белков и других соединений клеточной оболочки микроорганизма с активированными бифункциональными реагентами носителями (табл. 10.3). Возможна предварительная обработка носителя, [c.222]

Способ иммобилизации ферментов путем включения в полимерный гель отличается простотой применяемых методик, позволяет создавать иммобилизованные препараты любой геометрической конфигурации (сферические частицы, пленки и т. п.), обеспечивая при этом равномерное распределение биокатализатора в объеме носителя. Многие полимерные гели обладают высокой химической, механической и тепловой стойкостью, что дает возможность многократного использования иммобилизованных препаратов на их основе. Метод универсален, поскольку применим для иммобилизации практически любых ферментов, а также полиферментных систем, клеточных фрагментов и даже клеток. Важное преимущество метода состоит в том, что во многих случаях иммобилизация в геле приводит к значительной стабилизации ферментов. Наконец, фермент, включенный в гель, надежно защищен от инактивации вследствие бактериального заражения, поскольку крупные клетки бактерий не могут проникнуть в мелкопористую полимерную матрицу. [c.67]

К числу основных достоинств этого метода иммобилизации можно отнести его простоту и универсальность (возможность включения не только индивидуальных ферментов, но и полиферментных систем, клеток и клеточных фрагментов, ферментов, предварительно иммобилизованных каким-либо иным способом, и т.п.). Применение систем мембранного типа позволяет получать иммобилизованные препараты с высоким содержанием включенного фермента например, в каждый грамм волокон, изготовляемых методом влажного прядения, можно включить свыше 200 мг фермента. Иммобилизованные в мембранных системах ферменты в значительной степени сохраняют свою каталитическую активность, а их стабильность часто существенно возрастает. Эффект стабилизации обеспечивается, в частности, за счет исключения деградации ферментов под действием микроорганизмов, которые не могут проникнуть сквозь мембрану. Кроме того, благодаря высокому отношению поверхности к объему и малой толщине мембраны удается избежать значительных диффузионных ограничений скорости ферментативных реакций. [c.72]

Методы скрининга биохимических мутантов привели к появлению более продуктивных и приспособленных к условиям культивирования клеточных штаммов, используемых в промышленности. Возникли методы иммобилизации культивируемых клеток с целью биотрансформации химических соединений. [c.13]

Выделение клеток с флуоресцентными активированными клеточными сортерами (ФАКС) требует дорогостоящего оборудования и малопригодно для рутинных экспериментов, особенно при необходимости получения большого числа клеток. Следовательно, существует необходимость в более широко доступных и воспроизводимых методах разделения клеток. Аффинная хроматография в принципе представляет собой идеальный метод для очистки клеток он заключается в иммобилизации на твердых носителях лигандов, избирательно узнающих компоненты мембран. [c.243]

При проведении исследований тканеспецифичности природных НПК нами использован метод пространственной иммобилизации клеточных мембран мозговой ткани и предстательной железы в пористую полимерную матрицу полиакрилонитрила (Ряднова и др., 2001). В связи с тем что морфология и сорбционная емкость полученных аффинных сорбентов не были стандартизованы, аффинная хроматогра- [c.180]

На кафедре проводятся исследования по синтезу и изучению свойств синтетических неионных водорастворимых полимеров. Такие полимеры и гидрогели на их основе находят широкое применение в качестве флоку-лянтов для очистки сточных вод, для концентрирования и извлечения металлов, в качестве структурообразователей почв, в качестве плазмозаме-нителей, для стабилизации и очистки ферментов. Методом радикальной полимеризации синтезированы термоосаждаемые водорастворимые полимеры на основе винилкапролактама. Показано, что меняя природу со-мономера можно получать сополимеры с различной температурой фазового разделения., с различным конформационном состоянием макромолекул. При этом большое значение приобретает химическая природа растворителя. Способность к комплексообазованию таких полимеров позволило разработать способ получения гранулярного носителя и иммобилизации в него широкого спектра соединений, от пигментов до живых клеточных [c.115]

Еще 10 лет тому назад Н. Д. Иерусалимский — крупный советский микробиолог— писал Некоторые этапы химических синтезов трудны и сопровождаются образованием большого числа изомеров и побочных продуктов. В таких случаях полезную услугу могут оказать ферментные препараты или живые носители ферментов — микроорганизмы. От небиологических катализаторов они выгодно отличаются специфической направленностью своего действия. К тому же вызываемые ими биохимические процессы протекают при обычных температурах и давлении. Их осуществление не требует ни антикоррозийной аппаратуры, ни крупных энергетических затрат . В значительной мере благодаря его инициативе в СССР были начаты интенсивные исследования в области инженерной микробиологии. Однако, как уже говорилось выше, применение микроорганизмов в целях направленной трансформации органических веществ существенно ограничивалось спецификой работы с микроорганизмами или выделенными ферментами, которые требовали специальных условий для получения, сохранения и воспроизводства. В настоящее время известны пути стабилизации (иммобилизации) ферментов путем либо химической фиксации активной конформации с помощью дифункциональных (сшивающих) реагентов, либо химической прививки к полимерным носителям и даже к стеклу, либо включения в гель инертного полимера. Это позволило превратить ферменты из крайне нестойких веществ в довольно стабильные, препараты, которые могут неоднократно вводиться в реакционную массу в качестве катализатора. Более того, стало возможным, не выделяя фермент, проводить такую иммобилизацию прямо на клеточном уровне, используя выращенную культуру соответствующего микроорганизма. Все это позволяет рас-сч1итывать в ближайшие годы на широкое и эффективное В1недрение методов ферментативного превращения не только в лабораторную, но и в промышленную практику. Именно поэтому мы надеемся, что появление даже неполной сводки, составленной американскими специалистами, вызовет интерес у советского читателя. [c.6]

Сущность методов этой группы состоит в иммобилизации путем включения клеток в заранее подготовленную или образованную оболочку. Такой оболочкой может служить просто граница раздела фаз между двумя несмешивающимися жидкостями [331]. В этом случае клеточная суспензия эмульгируется в органическом растворителе и затем ресуспендируется в виде капель в водной фазе. Примером заранее приготовленной оболочки является полупроницаемая мембрана, используемая для микро- [c.173]

Разработка методов иммобилизации клеток этой бактерии в полиакриламидный гель (ПААГ), в мембраны из поливинилового спирта и адсорбция ее на целлюлозе позволила повысить эффективность метода трансформации стероидов. Для иммобилизации в ПААГ культуру выращивали описанным выше способом, отделяли центрифугированием, отмывали фосфатным буфером. Система для полимеризации состояла из 10 %-ного полиакриламидного геля с 0,5 %-ным относительным содержанием сшивающего агента метиленбисакриламида и катализаторов тетраметил-этилендиамина (ТЕМЕД) и персульфата аммония. Акриламид перекристаллизовывали перед употреблением из хлороформа. В сосуд для полимеризации помещали 6 мл клеточной суспензии, содержащей 0,1—0,6 г биомассы, смесь 1,90 г акриламида с 0,10 г метиленбисакриламида в 11 мл воды, 3 капли ТЕМЕД а и 15 мг персульфата в 3 мл воды. Общий объем 20 мл. Полимеризацию мономера проводили при температуре 10—12 °С в атмосфере азота в течение 2—15 мин. Полученный блок геля механически фрагментировали, продавливая через сито 20—30 меш, промывали физиологическим раствором до исчезновения невключившихся клеток (4—5 л). Полученные гранулы помещали в термостатируемую колонку (1X28 см). Реакционная смесь, пропускаемая через колонку, содержала 0,1 г/л гидрокортизона в фосфатном буфере (pH 7,0), скорость потока через колонку 1,3 мл/ч на 1 мл геля (ЗУ), акцептор водорода — феназинметасульфатдобавляли в концентрации 0,1 г/л с момента трансформации, температура 20—22 °С. Выделение стероидов и определение активности проводили по методике, описанной выше. При таких условиях [c.545]

Несмотря на описанные выше проблемы в разработке методов микроинъекций для растительных клеток, особенно протопластов, достигнут большой прогресс. В ранних исследованиях проводили инъекции в цитоплазму протопластов табака при 70%-ной выживаемости [40]. В этих экспериментах использовали клетки двух-, трехдневного возраста, полученные из протопластов, которые сформировали тонкую клеточную стенку и способны прикрепляться к покровному стеклу, покрытому по-ли-Ь-лизином (рис. 3.7,Л). За микроинъекцией наблюдали вводя флуоресцентный краситель (Lu ifer yellow). Однако игла микроинъектора редко попадала в ядро из-за того, что при использовании этого метода иммобилизации протопластов/клеток трудно локализовать ядра. С тех пор сообщалось, что поли-L-лизин часто обладает токсическим действием по отношению к протопластам. [c.223]

Наконец, несколько слов о так называемых иммобилизованных микробных клетках, которые получают все большее распространение и характеризуются снижением расхода времени и дорогих этапов очистки. Иммобилизация клеток достигается аналогичными методами, что и свободных ферментов. Огромным преимуш,еством иммобилизованных клеточных систем является замена ими сложных ферментационных процессов, таких, как получение вторичных продуктов микробного метаболизма (производство синтетических антибиотиков), в постоянно контролируемых химических процессах с использованием ферментных электродов, водных анализах и обработках отходов, непрерывных солодовых процессах, азотфиксации, синтезе стероидов и других медицинсьсих продуктов. [c.93]