Химическое секвенирование

Рис. 11.14. Схема эксперимента по секвенированию фрагмента ДНК по методу Максама — Гилберта. А — схема специфической химической модификации нуклеотидов в ДНК Б — результат электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле и его интерпретация. Цифры в скобках — длина фрагментов, выраженная в

Рис. 5.3. Схема электрофореграммы, полученной с помощью химического метода секвенирования ДНК (первая снизу строка соответствует нуклеотиду на 5 -конце и является нуклеотидом Т на уровне первой дорожки. Для определения полной последовательности (отмечено пунктиром) проводят анализ послойно всех дорожек

Молекулярная биотехнология — это увлекательнейшая область научных исследований, с появлением которой произошел настоящий переворот во взаимоотношениях человека с живой природой. В ее основе лежит перенос единиц наследственности (генов) из одного организма в другой, осуш ествляемый методами генной инженерии (технология рекомбинантных ДНК). В большинстве случаев целью такого переноса является создание нового продукта или получение уже известного продукта в промышленных масштабах. В ч. I мы познакомим читателя с концепциями молекулярной биотехнологии и теми микроорганизмами, которые в ней используются, с основами молекулярной биологии и методологией рекомбинантных ДНК. Будут описаны такие методы, как химический синтез генов, полимеразная цепная реакция (ПЦР), определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК. Помимо успешного клонирования нужного гена очень важно обеспечить его правильное функционирование в организме нового хозяина, поэтому мы остановимся также на способах оптимизации работы клонированных генов в про- и эукариотических системах. И наконец, мы рассмотрим, как можно улучшить свойства конечных продуктов, модифицируя клонированные гены путем введения в них специфических нуклеотидных замен (мутагенез in vitro). В целом материал, изложенный в первой части, служит фундаментом, который позволяет понять различные аспекты конкретных применений молекулярной биотехнологии. [c.13]

Принцип, на котором основан метод построения рестрикционных карт, очень похож на тот, который используется при химическом секвенировании ДНК. В обоих случаях молекулы метят на одном конце, затем частично фрагментируют с помощью неполного расщепления в нескольких специфических сайтах и, наконец, распределяют фрагменты по размерам. Длина меченого фрагмента указывает на расстояние от меченого конца до сайта, по которому произошло расщепление. [c.309]

Химический сиквенс основан на избирательной химической деградации нуклеотидов. Он был предложен в 1977 г. А.М. Максамом и В. Гилбертом и назван их именем. Для секвенирования этим методом необходимо получить одноцепочечную молекулу ДНК, один из концов которой метят с помощью изотопа фосфора препарат меченой ДНК делят на четыре порции и каждую обрабатывают реагентом, специфически разрушающим одно или два из четырех оснований. Так, например, добавление 60 %-ной муравьиной кислоты разрушает пуриновые основания (А + Г), прибавление диметилсульфата — только гуанидиновые основания чистый гидразин разрушает пиримидиновые основания (Т + Ц), а в присутствии 1,5 М Na l избирательно разрушаются только цитозиновые основания. Очень важно подобрать условия реакции таким образом, чтобы на каждую молекулу ДНК приходилось лишь несколько повреждений. При обработке поврежденных молекул пиперидином в ДНК образуется разрыв в том месте, где находилось разрушенное основание. [c.30]

К числу наиболее важных для молекулярной биотехнологии методов, помимо клонирования генов, относятся методы химического синтеза ДНК, секвенирование ДНК и полимеразная цепная реакция (ПЦР). [c.102]

Нуклеотидная последовательность ДНК. Почему при секвенировании ДНК химическим методом молекула ДНК должна быть меченой только по одному концу, а не равномерно [c.892]

Рис. 4-67. Химический метод секвенирования ДНК. Процедура, описанная на рис. 4-66, выполняется одновременно для четырех одинаковых проб ДНК. При этом используют химические агенты, расщепляющие ДНК в первом случае по Т, во втором по С, в третьем по С и четвертом по А Полученные образцы подвергают электрофорезу на параллельных дорожках одного геля, как это указано на рис. 4-64, А. Анализируя результаты электрофореза, можно определить последовательность ДНК. Так, первая снизу полоса соответствует нуклеотиду, расположенному на 5 -конце. При этом определяют, на какой из дорожек расположена полоса, - в данном случае это Т. Для определения полной последовательности эту же процедуру выполняют на уровне второй, затем третьей полосы и так далее. В данном случае метод идеализирован на самом деле химическая

Три этапа химического секвенирования модификация основания, удаление модифицированного основания, разрыв цепи в месте расположения свободной дезоксирибозы. В данном примере модифицируемым основанием является гуанин. [c.321]

ТОЛЬКО один из концов (рис. 7.9, В). На рис. 7.10 представлены результаты химического секвенирования, [c.324]

Введение 5 -концевой метки в двух цеп очечную ДНК, используемую для химического секвенирования. Пред- [c.324]

Наряду с химическим расщеплением секвенирование РНК можно проводить путем гидролиза ее цепи специфическими РНК-азами. [c.20]

Секвенирование — общее название физико-химических методов определения первичной структуры белков и нуклеиновых кислот. [c.555]

Олигонуклеотиды, синтезированные химическими методами, находят широкое применение в молекулярной биотехнологии. Их используют в качестве зондов при ДНК-гибридизации, линкеров, соединяющих разные молекулы ДНК в экспериментах по клонированию, праймеров при секвенировании ДНК или осуществлении сайт-специфического мутагенеза клонированных генов-мишеней. [c.85]

Современные методы секвенирования (метод химической деградации ДНК Максима — Гилберта и метод синтеза ДНК на матрице в присутствии терминаторов синтеза Сэнгера) в своей основе разработаны в 1977 г. Идея методов состоит в следующем [c.284]

Получение наборов фрагментов, имеющих концы. Химическое секвенирование основано на специфической модификации различных пуриновых и пиримидиновых оснований. Эти модифицированные основания выщепляют затем из полимерной цепи с сохранением сахаро фосфатного остова. Далее гидролизуют относительно нестабильные фосфодиэфирные связи, соседствующие с сайтом, где находилось удаленное модифицированное основание, в результате чего цепь разрывается. Все эти реакции схематически представлены на рис. 7.5, где в качестве примера рассмотрена модификация гуаниновых остатков. Реакции, специфичные в отнощении разных оснований, приведены на рис. 7.6. Представлены две реакции, одна из которых специфична в отнощении только гуанина, а другая — только цитозина, и две реакции, специфичные в отнощении либо пуринов, либо пиримщщнов. Каждую из четырех реакций проводят с использованием отдельного препарата ДНК, в результате чего получают четыре набора фрагментов, необходимых для точного определения последовательности. Глубина [c.321]

Образование родственных набфов цепей при химическом секвенировании. В данном примере модифицируются и элиминируются остатки дезоксицитидина. Для [c.324]

Результаты химического секвенирования. Цепи были помечены на 5 -концах. Последовательность считывается в направлении 5 ->3. Надписи над дорожками указывают, какие специфические реакции использовались в каждом случае. (С любезного разрещения R.E. Thayer.) [c.325]

ИСХОДИТ в случайных сайтах, образуется набор цепей всех возможных длин, начиная с 5 -конца праймера до сайтов, соответствующих положению присоединенного дидезоксинуклеотида (рис. 7.12). Новосинтезированные цепи являются радиоактивно меченными, поскольку в реакции используется по меньщей мере один радиоактивно меченный дезою и-нуклеозидтрифосфат. Часто им является а- -Р-дезоксинуклеозидтрифосфат, но это может быть также 8-(а-тио)-дезоксинуклеозид1рифосфат (рис. 7.13). Иногда используется радиоактивно меченный праймер. Продукты четырех реакций подвергают одновременному электрофорезу на отдельных дорожках, как при химическом секвенировании. Последовательность считывают с радиоавтографа, который выглядит так же, как и радиоавтофаф, полученный при использовании химического метода секвенирования (рис. 7.10). [c.326]

Метод химического секвенирования может применяться для анализа специфических последовательностей ДНК, присутствующих в смеси наряду с больщим числом разных молекул ДНК, в том числе даже естш речь идет об одном гене в суммарной геномной ДНК млекопитающих. Прежде всего ДНК разрезают с помощью рестриктирующей эндонуклеазы, так что интересующий нас сегмент [c.327]

Существует два принципиально различных подхода к определению нуклеотидной последовательности ДНК. Первый из них предложен А. Максамом и У. Гилбертом и основан на специфическом химическом расщеплении полинуклеотидной цепи. Последовательность операций при секвенировании ДНК методом Максама — [c.15]

Дополнение 27-1. Секвенирование короткого фрагмента ДНК при помопщ химического метода Максама-Гилберта [c.887]

Максам и Гильберт использовали для секвенирования меченные по 5 -концам радиоактивным фосфором одинарные нити денатурированных фрагментов ДНК [Махат, Gilbert, 1977]. Были разработаны химические методы расщепления полидезоксирибо-нуклеотидов по заранее известным нуклеотидам. Концентрации реагентов и условия гидролиза подобрали так, что подавляющее большинство индивидуальных нитей случайным образом разрывалось только в одном из множества возможных мест. Все эти места равноправны. В результате при каждом методе обработки огромного множества нитей получали полный набор всех возмож- [c.131]

С помощью этого метода за короткий срок удалось установить полную нуклеотидную последовательность ДНК SV 40, рекомбинантной плазмиды pBR322 и многих других последовательностей ДНК. Однако секвенирование методом Максама-Гилберта имеет ряд недостатков, связанных с длительностью и значительной трудоемкостью процедур. В настоящее время на основе секвенирования с помощью химической деградации разработаны усовершенствованные и быстрые методы определения нуклеотидной последовательности, в том числе твердофазное секвенирование и секвенирование с использованием обращенно-фазовой хроматографии. [c.30]

Кроме метода химической модификации нуклеиновых кислот в настоящее время широко применяется метод секвенирования ДНК с помощью высокоспецифичных ферментов — рестриктаз — на отдельные фрагменты, а также использование ДНК- олгше/ азы — фермента синтеза ДНК in vivo (см. главы 11 и 19). [c.272]

В конце 70-х годов были разработаны методы для простого и быстрого определения последовательности нуклеотидов (секвенирования) любых очищенных фрагментов ДНК. Вслед за этим были определены полные последовательности нуклеотидов многих генов млекопитающих. включая гены, кодирующие гемоглобин, инсулин и цитохром с. Объем информации о последовательностях ДНК столь велик (многие миллионы нуклеотидов), что для хранения и анализа имеющихся данных необходимо использовать компьютеры. Секвенировано несколько протяженных последовательностей ДНК, содержащих более 10 пар нуклеотидов среди них полный геном вируса Эпщтейна-Барр (вызывающего у человека инфекционный мононуклеоз), а также полный геном хлоропластов растений. В настоящее время щироко используются два различных метода секвенирования ДНК принципы, лежащие в основе химического метода иллюстрированы рис. 4-66 и 4-67. ферментативный метод объясняется на рис. 4-68. [c.234]

Модификация метода секвенирования ДНК, представленная на рис. 4-66 и 4-67, может быть использована для выявления в ДНК последовательностей, опознаваемых ДНК-связывающими белками. Связывание этих белков с регуляторными участками ДНК (которые обычно локализованы вне кодирующих участков генов), по-видимому, играет важную роль в определении того - какие именно гены активны в данном типе клеток. Понимание функции этих белков чрезвычайно важно для идентификации специфических последовательностей, с которыми они связываются. Для выявления таких последовательностей обычно используют метод, именуемый ДНК-футпринтинг. Сперва очищенный фрагмент ДНК метят по одному концу Р и затем расщепляют с помощью нуклеазы или химического соединения, делающего случайные разрезы в двойной спирали ДНК. Фрагменты, которые образуются из меченой цепи, разделяют на геле и выявляют на радиоавтографе после этого сравнивают расположение полос ДНК. образуемых в присутствии и в отсутствие ДНК-связываюших белков. Если связывание произошло, нуклеотиды в сайте расщепления оказываются защищен- [c.235]

Опухоли часто возникают не от вирусной инфекции, а в результате мутаций, происходящих случайно или же под действием химических канцерогенов или облучения. Из таких опухолевых клеток можно получить очищенную ДНК и проверить ее на наличие онкогенов путем введения в нетрансформированные клетки в культуре in vitro. Для такого теста часто используют клетки ЗТЗ, поскольку они неопределенно долго делятся в культуре и содержат мутации, благодаря которым их легко трансформировать добавлением всего лишь одного онкогена. Онкоген, ответственный за такую трансформацию, может быть выделен, клонирован и секвенирован с помощью метода рекомбинантной ДНК (рис. 13-33). Нримечательно, что в большинстве случаев, когда это было сделано, онкоген оказывался мутантной формой одного из тех самых протоонкогенов, которые были выделены с использованием ретровируса, хотя при этом было открыто и несколько новых онкогенов. [c.428]

МО иметь большое количество идентичных молекул ДНК. Наработку интересующей последовательности можно осушествить клонированием соответствующего фрагмента. Проиллюстрированный на рис. 36.6 метод секвенирования по Максаму-Гилберту основан на химическом расщеплении ДНК по определенному основанию. Другой ферментативный метод—метод Сэнгера—базируется на применении аналогов нуклеотидов, прерывающих синтез комплементарной цепи ДНК по одноцепочечной матрице в месте встраивания в цепь соответствующего аналога. [c.44]

Как правило, первичную структуру белка не удается установить путем последовательного секвенирования всей полипептидной цепи. Для этого приходится анализировать фрагменты, полученные избирательным расщеплением полипептидной цепи химическим или ферментативным методом. Следователыю, стадия фрагментации полипептидной цепи па низкомолекулярные пептиды с целью последующего структурного анализа — это один из важнейших этапов в определении ковалентно (первичной) структуры белка. [c.82]

Простота, с которой можно получить четкие надежные данные, не прибегая к клонированию в бактериях, определяется 1) способностью ПЦР-затравок амплифицировать только интересующие последовательности (специфичность праймера) и 2) способом получения образца, приемлемого для секвенирования. Для прямого секвенирования продуктов ПЦР вполне пригоден химический метод (Максама — Гилберта). Мы рассмотрим здесь только наиболее распространенный метод Сэнгера, использующий нуклеотиды-терминаторы полимеразной реакции. Специфичность ПЦР-затравок в принципе определяет гомогенность амплифицируемых последовательностей. В идеале, в результате реакции экспоненциально наращивается только интересующая последовательность. Однако в реальных условиях многие праймеры амплифицируют также различные посторонние последовательности. Повышая температуру отжига в полимеразной реакции, это осложнение удается преодолеть [12]. К тому же для устранения затруднений, связанных со свойствами конкретной амплифицируемой последовательности, можно применить предварительную очистку интересующей последовательности электрофорезом в геле или использовать денатурирующий градиентный гель [15]. [c.185]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология