Справочник химика 21

Химия и химическая технология

Статьи Рисунки Таблицы О сайте English

Клонирование клеток

Таблица 3.2. Процедура клонирования клеток в полужидком агаре Таблица 3.2. <a href="/info/1875660">Процедура клонирования</a> клеток в полужидком агаре

    Клонирование клеток в полужидком агаре [c.139]

    Штамм — происходит из первичной культуры или клеточной линии при селекции или клонировании клеток, имеющих специфические свойства или маркеры. [c.499]

    Клонирование клеток методом лимитирующих разведений [c.140]

    Рассмотрим теперь более подробно, каким образом гены выделяют, вводят в клетки-хозяева, клонируют и осуществляют трансляцию с целью получения тех или иных продуктов. Слово клон имеет греческое происхождение и означает побег или черенок, применяемый для размножения растения. Оно используется в двух смыслах. Во-первых, под термином клонирование клеток понимают образование группы генетически идентичных клеток, развившихся из одной клетки, как это имеет место в случае линии иммуноцитов, настроенных на синтез определенного типа антител. Под термином же молекулярное клонирование или клонирование генов имеют в виду образование множества идентичных копий гена, полученных в результате репликации одного гена, введенного в клетку-хозяина. [c.983]

    Генетическую однородность клеточных линий можно усилить еще больше путем клонирования, т. е. выделив отдельную клетку и позволив ей пролиферировать до образования большой колонии. Клон - этого популяция клеток, происходящих из одной клетки-предшественника. Клонирование клеток используется в основном для получения клеточных линий, у которых мутация затронула определенные гены. Исследование таких мутантных клеток, дефектных по специфическому белку, позволяет узнать много нового о функции белка в нормальных клетках. [c.206]

    VI. клонирование клеток, полученных от пациентов, не получавших лекарств, для обнаружения неодинаковой чувствительности к лекарствам и механизмов первичной резистентности. [c.302]

    Клонирование клеток гибридом [c.194]

    Клонирование клеток и эффективность посева [c.88]

    Клонирование клеток в полужидкой или вязкой среде 395 [c.395]

    Без методов иммуноферментного анализа невозможно представить себе развитие клеточной инженерии. В частности, получение гибридом целиком базируется на использовании иммуноферментного анализа при клонировании клеток. При генноинженерных работах эти методы позволяют быстро отбирать клоны-продуценты. Методы иммуноферментного анализа эффективны при решении фундаментальных проблем онкологии, вирусологии, биохимии и физиологии. [c.122]

    Все манипуляции, описываемые в этой главе, необходимо проводить в стерильных условиях и со стерильными реагентами. Растворы следует готовить только из реактивов, предназначенных для культивирования клеток, обязательно использовать для этого бидистиллированную воду. Важно, чтобы читатель был хорошо знаком со стандартной техникой культивирования и клонирования клеток. [c.10]


    Применение методологии генетики бактерий к изучению эукариот (клонирование клеток, применение трансформации, использование рестриктирующих эндонуклеаз и т. д.) стало основой нового синтетического направления в биологии — генетической инженерии, о которой подробнее сказано в гл. 11. [c.224]

    Прогресс в расшифровке генетических механизмов, контролирующих индивидуальное развитие, зависит от возможности использования удобных генетических моделей. Это означает, что процесс индивидуального развития необходимо разложить на элементарные признаки — фены, наследующиеся по альтернативной схеме. В этой главе было приведено несколько примеров таких моделей. Большие надежды вселяет применение новейших методов исследования, связанных с клонированием клеток и генов, возможность получения целых организмов из отдельных соматических клеток. [c.437]

    Получаются ли при использовании препарата повторяющиеся результаты Обнаруживают ли молекулы идентичные свойства при работе с разными препаратами Изменения в состоянии живых организмов, из которых молекулы были выделены, или неизбежные небольшие вариации при работе с особо чувствительными системами могут приводить к получению измененных структур. Хорошим контролем постоянства препаратов являются функциональные тесты. Имеется и ряд щадящих физических измерений, достаточно чувствительных для того, чтобы служить контролем качества препаратов. Если известна причина неидентичности препаратов, иногда ее удается устранить. Например, повреждение РНК за счет ферментативного расщепления может быть сведено к минимуму путем выделения ее из мутантных бактериальных штаммов, обладающих дефектными или неактивными расщепляющими РНК ферментами присущая живым организмам вариабельность может быть резко уменьшена за счет использования животных клеток, растущих в культуре в стандартных условиях. Генетические вариации могут быть устранены путем использования клонированных клеток, происходящих от одного генетически чистого предшественника. [c.24]

    Качество посуды, процесс ее мытья и выбор детергента следует периодически проверять. Для этого лучше всего промыть посуду обычным образом, оценить чистоту на глаз, высушить, простерилизовать и использовать для клонирования клеток в монослое (гл. 4 и 8) предпочтительно при низкой концентрации сыворотки (2—5%) или в ее отсутствие (см. гл. 2). [c.21]

    Результаты исследования определяются тестами на цитотоксичность и тестами, в которых анализируется выживание клеток. В тестах на цитотоксичность определяют индуцированные лекарствами изменения в метаболических путях или структурной целостности, которые могут иметь и не иметь непосредственного отношения к гибели клеток. В тестах на выживание определяется конечный результат метаболических нарушений, которые могут приводить либо к восстановлению клеток, либо к их гибели. Теоретически единственным достоверным показателем выживаемости пролиферирующих клеток является способность их к дальнейшему размножению, что определяется клонированием клеток. В качестве показателя выживаемости могут быть [c.268]

    Эффективность клонирования клеток в монослое, как правило, выше, чем в мягком агаре, поэтому этот метод часто используется при работе с линиями клеток. Нормальные и опухолевые клетки могут образовывать колонии в монослое, так что этот метод неприменим к биопсипному материалу опухолей, который обычно характеризуется высоким уровнем примесей клеток стромы. Метод клонирования в монослое биопсий опухолей [c.273]

    Основная программа эксперимента — накопление, размножение и клонирование клеток, продуцирующих нужные антитела, и в конечном счете получение стабильных клонов путем гибридизации. [c.158]

    КЛОНИРОВАНИЕ КЛЕТОК В ПОЛУЖИДКОЙ ИЛИ ВЯЗКОЙ СРЕДЕ [c.391]

    Клонирование клеток е полужидкой или вязкой среде 393 [c.393]

    Клетки нз всех лунок, оказавшиеся при скрининге положительными, надо субкультивпровать. Для этого переносите содержимое этих лунок в 24-луночиый планшет и добавьте в каждую лунку по 0,5 мл свежей среды. Клетки из такого планшета могут служить источником для клонирования клеток данной гибридомной линии кроме того, их можно рассеять на чашке Петри диаметром 90 мм и заморозить. Если слияние оказалось очень удачным, можно сразу не справиться с размножением и клонированием слишком большого количества клеток. В такой ситуации лучше выбрать только пять или десять положительных колоний для немедленного их размножения, а остальные заморозить до проведения дальнейших исследований. После размножения колоний в планшете с 24 лунками скрининг следует повторить и, кроме того, провести и более жесткий скрининг другим способом. Если в результате слияния во многих лунках наблюдается рост клеток и обнаруживаются антитела к -галактозидазе, но не обнаруживается антител к белковому продукту встроенного фрагмента, тогда единственно, что остается делать, — это повторить слияние в тех же условиях, в которых проводилось предыдущее. Если, однако, в результате слияния вообще образуется небольшое число клонов гибридных клеток, тогда стоит попробовать внести изменения в методику слияния. К ним относятся использование так называемого питающего слоя для роста клеток и внесение в среду добавок. [c.192]

    Газовый обмен возможен это имеет место при использовании чашек Петри, пластинок для культур клеток и некоторых типов сосудов для суспензионных культур. Когда используемая среда, забуферивается бикарбонатом (30 мМ), необходимо, чтобы эти культуры находились в смеси 5% СОг с воздухом. Это обеспечивает поддержание правильного pH, который легко контролируется по цвету присутствующего в среде фенолового красного. Среда должна быть томатного цвета, что соответствует pH 7,2, но не желтого или красного и ни в коем случае не пурпурного. При забуферивании среды до pH 7,2 с помощью буфера Нерез (20 мМ разд. 7.2.1) отпадает необходимость в контроле рСОг окружающей атмосферы. В некоторых случаях, особенно при клонировании клеток, буфер Нерез (20—25 мМ) используется в комбинации с бикарбонатом (8 мМ), и в этих случаях культуральные сосуды должны содержаться в атмосфере с [c.30]


    Для отдельных линий клеток разработаны специальные среды, обеспечивающие оптимальный рост этих линий или возможность их культивирования в бессывороточной среде. Так, среда МакКоя 5А (МсСоу et al., 1959) используется как стандартная среда для клонирования клеток. Она основана на СБСР и аминокислотах и витаминах из среды 199 (приложение 1 табл. 18). [c.80]

    Снять клетки с подложки 0,25%i-ным трипсином в СБСР или ФСБ (двухвалентные ионы улучшают эффективность посева) и диспергировать их мягким и кратковременным пи-петированием. Трипсинизация при 4 С в течение 2—10 мин особенно рекомендуется в случаях клонирования клеток при низкой концентрации сыворотки. [c.89]

    Повторять последние 3 раза стадии каждые 3 дня, получая каждый раз чашки, являющиеся репликами исходной. Клетки на бумажных дисках сохраняют жизнеспособность и могут быть использованы для радиоавтографического анализа. С другой стороны, они могут быть лизированы замораживанием и оттаиванием и инкубированы в ферментативном тесте. Другим методом, приводящим к тому же результату, является посев мутагенизированных клеток в пластинку для микротитрования с 96 лунками, как для клонирования клеток. Когда колонии вырастут, клетки можно собрать и распределить между несколькими микротитровальными пластинками, используя ручные или автоматические сборщики клеток и разбавители, поставляемые Titertek (Flow Labs. Ltd.). [c.189]

    К основным методам клонирования клеток относятся клонирование методом лимитирующих разведений, клонирование в полужидком агаре и клонирование с помощью прибора — проточного цитофлуори метра. [c.109]

    Надеемся, что материалы, представленные в этой главе,, смогут послужить отправной точкой для исследователей, желающих овладеть методами трансфекции клеток млекопитающих. Однако не следует относиться к приведенным данным догматически. Если какой-то метод у вас не работает, то, во-первых, проверьте эффективность клонирования клеток-реципиентов при используемых условиях эксперимента, во-вторых, проконсультируйтесь в лаборатории, где этот метод отработан, и,, в-третьих, поварьируйте условия. Желаем удачи  [c.29]

    Разделы сборника, посвященные методам элютриации и проточной цитометрии, заинтересуют в первую очередь исследователей, работающих в области молекулярной биологии клетки. Эти два новых метода хотя и требуют дорогостоящего оборудования, но зато позволяют получать принципиально новые результаты. При чтении главы о проточной цитометрии особое внимание следует обратить на возможные сферы применения этого метода сравнительный анализ ответов индивидуальных клеток на те или иные воздействия и отбор индивидуальных клеточных популяций, идентичных по тому или иному параметру. В настоящее время, когда появляется все больше данных о гетерогенности клеток в тканях и даже в клеточных культурах, использование проточной цитометрии в сочетании с современными методами клонирования клеток сулит весьма увлекательные перспективы. [c.5]

    Клетки, получаемые непосредственно из опухолей, можно клонировать на стекле в виде монослойной культуры. Однако в последнее время появляется все больше данных о клонировании клеток в суспензии, при котором удается избавиться от стро-мальных элементов, которым необходима для роста твердая подложка. Теоретически преимущество клонирования в суспензии состоит в том, что в такой системе эффектам подвержены лишь клетки с высокой способностью к самообновлению (возможно, стволовые клетки опухолей) клетки с низкой пролифе-ративнои активностью, составляющие большую часть опухоли, в формировании ответа не участвуют. Это, однако, справедливо только в том случае, когда колонии представляют собой истинные клоны (то есть возникают из единичной клетки, а не из клеточного агрегата) и подсчет их производится после многих клеточных генераций. В реальных исследованиях эти требова- [c.262]

    Метод Куртеней . Для клонирования клеток в суспензии [51] в качестве фидерных клеток используются эритроциты крыс и поддерживается парциальное давление кислорода 5%. Может быть использована описанная выше процедура с соответствующими модификациями условий окончательного посева. [c.284]

    Если клетки после слияния рассевают в лунки панели для микротитрования, то гибридомы, продуцирующие антитела нужной специфичности, затем пересаживают в 24 луночные панели для культуры тканей с объемом лунок 2 мл. Далее при образовании монослоя и окращивания среды в желтый цвет, супернатант можно повторно тестировать, используя определенный набор антигенов. Если результаты тестирования удовлетворительные, то гибридому наращивают в нескольких лунках, затем в универсальных контейнерах и далее во флаконах постепенно возрастающего объема. К этому времени обычно уже происходит самопроизвольное клонирование клеток. Тот клон, который отличается наилучщим ростом (предполагаемый источник антител), постепенно получает преимущество над всеми другими в культуре. [c.138]

    В том случае, когда клетки после слияния рассевают в лунки панели для культуры ткани объемом 2 мл, вероятность того, что в одной лунке окажется более одного клона, повышается. Просматривая культуры под инвертированным микроскопом, можно наблюдать два и более клонов в лунке. Клонирование клеток, продуцирующих антитела нужной специфичности, предпринимают немедленно после образования монослоя (обычно па 21—28-е сутки после гибридизации). Тем не менее гибридо-ыу продолжают наращивать в нескольких лунках, а затем во флаконах, пока не образуется достаточное для замораживания и хранения в жидком азоте количество клеток. Необходимо иметь, по меньшей мере, пять ампул исходной клеточной взвеси на случай, если возникнут трудности или неудачи при клонировании. Во время культивирования гибридомы во флаконах культуральную среду тестируют для выявления антител нужной специфичности. Если наблюдается прогрессирующее сни-жение образования антител на стадии роста культуры во флаконах, то это означает, что несекретирующие варианты гибридных клеток обогнали в росте антителообразующие клетки, В таком случае важно отобрать антителообразующие гибрид ные клетки путем клонирования, а небольшое количество клеток из этих флаконов сохранить для последующих процедур клонирования. Клонирование клеток из тех флаконов, где а культуральной среде выявляют прогрессивное снижение образования антител, почти всегда безуспешно. Если все же очень важно выделить такую клеточную линию, то следует извлечь из жидкого азота и разморозить образец клеток, замороженный на самой ранней стадии культивирования и сразу же после восстановления клеток в культуре провести клонирование. Клони-рование может быть осуществлено либо путем высевания небольшого количества клеток в мягкий агар, либо с помощью лимитирующих разведений. [c.139]

    Методы культивирования в полужидкой среде основаны на ее высокой вязкости, что обеспечивает разъединенность внесенных в культуру клеток и, следовательно, дискретность развивающихся колоний. Растворимые компоненты легко диффундируют в полужидком носителе — матриксе и вследствие этого равномерно распределяются по всему объему культуры. Два главных преимущества клонирования клеток в полужидком агаре состоят в том, что с помощью этого метода легко проанализировать большое число клеток и легко визуализировать образующиеся клоны. Правда, недостаток всех методов клонального анализа — возможность случайного совмещения клонов, — разумеется, присущ и культивированию в полужидкой среде. Вероятные при этом ошибки оценивают в экспериментах по титрованию, которые позволяют установить порядок наблюдаемых событий. Для этого подбирают условия, при которых в ограниченном числе оказываются клетки только одного типа. Данные условия определяют по линейной зависимости между числом вносимых в культуру клеток и числом подсчитываемых событий (т. е. числом колоний). Таким образом были найдены условия как для роста sIg+В-клеток (Kin ade, 1981 а, Ь), так и для роста предшественников В-клеток (Paige, 1983, 1984 Paige et al., 1984). [c.255]

    Для клонирования клеток обычно используют среды, содержащие 0,3% агара (0,3%-ный раствор атара иногда называют мягким , а 0,5%-ный — твердым последний используют для приготовления нижних, или питательных, слоев, когда важно жестко иммобилизовать клетки. Однако при таких высоких концентрациях агара клеточный рост сильно подавляется. Добавляют 1 г агара (Бактоагар Dif o) к 100 мл дистиллированной воды и кипятят в колбе Эрленмейера. Этот раствор помещают в водяную баню при 43°С при такой температуре раствор агара не застывает. (Образование геля происходит при комнатной температуре. В таком виде его можио хранить. Перед использованием агар растапливают, поместив на кипящую водяную баню.) [c.392]

    Тканевые культуры должны помочь изолировать от дельные клеточные линии из кроветворной и лимфоидно ткани и определить различные категории клеток-предшест венников, входящих в состав этих тканей. Разработанньи недавно методы клонирования клеток кроветворной ткан в культурах позволяют уже сейчас проводить исследовани в этих важных направлениях. [c.4]


Смотреть страницы где упоминается термин Клонирование клеток: [c.211]    [c.261]    [c.13]    [c.77]    [c.88]    [c.29]    [c.318]    [c.397]   
Молекулярная биология клетки Том5 (1987) -- [ c.185 ]

Основы биохимии Т 1,2,3 (1985) -- [ c.983 ]

Методы культуры клеток для биохимиков (1983) -- [ c.88 ]

Методы исследований в иммунологии (1981) -- [ c.391 , c.396 , c.407 , c.409 ]

Гены и геномы Т 2 (1998) -- [ c.202 ]

Сборник Иммуногенез и клеточная дифференцировка (1978) -- [ c.102 , c.104 , c.108 , c.111 , c.170 ]




ПОИСК







© 2025 chem21.info Реклама на сайте