Аминокислоты, анализ методом изотопного разбавления

Аминокислотный состав белков. — Анализ гидролизата белков, содержащего до двадцати различных аминокислот (см. табл. 39), является чрезвычайно сложной задачей. Риттенберг (1940) разработал метод изотопного разбавления, согласно которому радиоактивную кислоту определенной удельной активности, например меченую глутаминовую кислоту, добавляют в известном количестве к анализируемой смеси, после чего выделяют глутаминовую кислоту обычным образом. Так как химические свойства природной и меченой кислоты одинаковы, то выделяемое вещество является смесью добавленной аминокислоты и первоначально присутствовавшей в пробе. Количество кислоты в гидролизате вычисляют по изотопному составу выделенной кислоты. Если добавляется рацемическая меченая кислота, то аминокислоты гидролизата перед выделением рацемизуют или же из выделенного рацемата отделяют чистую -форму. Точность анализа не зависит от метода выделения, выхода кислоты или концентрации ее в гидролизате. [c.655]

Первая часть этой задачи решается с помощью процессов гидролиза, происходящих под влиянием энзимов или сильных щелочей и кислот. Особенно хорошие результаты получаются при использовании в качестве гидролизующего агента 6 н. НС1. В этом случае для полного расщепления белковых молекул на аминокис-, лоты необходима обработка белка 6 н. НС1 при температуре 100° С в течение 10—15 ч. Вторая часть этой задачи — анализ образующихся весьма сложных смесей аминокислот — сопряжена с более серьезными трудностями. Обычные методы анализа подобных смесей, связанные с необходимостью количественного выделения всех компонентов смеси, очень трудоемки и приводят к большим погрешностям. Этим объясняются сильные расхождения — в несколько десятков процентов, — при анализе аминокислотного состава различных белков. Метод изотопного разбавления позволяет достигать точности до нескольких десятых долей процента. В этом случае к гидролизату добавляется одна из входящих в его состав аминокислот, меченная углеродом-14. После этого из раствора осаждается некоторое количество определяемой аминокислоты и проводится тщательная очистка ее от примесей. Зная [c.115]

Анализ с помощью метода изотопного разбавления позволяет избежать полного количественного разделения компонентов смеси. Исследуемый белок подвергают гидролизу, после чего в полученный раствор добавляют известное количество одной из аминокислот, предварительно меченной радиоактивным углеродом. (Заметим, что в данном случае молекулы не обязательно должны содержать метку в строго определенном положении). В растворе меченая аминокислота равномерно смешивается с аналогичной немеченой кислотой белка, после чего проводится частичное выделение из раствора исследуемой аминокислоты. Определив активность и массу выделенной порции аминокислоты по формуле (6.13), рассчитывают содержание данной аминокислоты в белке. [c.313]

Предположим, что мы определили аминокислотный состав белкового гидролизата и хотим установить количество содержащегося в нем валина. С этой целью к смеси добавляют небольшое точно взвешенное количество меченого С-валина известной удельной радиоактивности, после чего смесь тщательно перемешивают. Затем с помощью заранее отработанного метода выделяют из гидролизата чистый валин, измеряют удельную радиоактивность разбавленного валина и вычисляют коэффициент разбавления. Предположим, он оказался равным 75. Зная вес меченого валина, первоначально добавленного к гидролизату, можно легко вычислить вес валина, содержащегося в исходном гидролизате. До изобретения аминокислотного анализатора ]Мура и Штейна метод изотопного разбавления широко применялся для анализа аминокислот в белковых гидролизатах. Этот метод и сейчас довольно часто используется в тех случаях, когда необходимо установить, является ли данное соединение предшественником другого соединения в процессе его биосинтеза. Так, например, в последовательности реакций [c.476]

Этот метод может быть, наиример, использован для определения истинного выхода химической реакции в том случае, если выделение веществ затруднительно. Он применим к химическому анализу всех видов—это по существу наиболее известный общий метод,—но особенно хорош он для исследования смесей веществ, близких по своим свойствам. Смесь аминокислот, полученная при гидролизе белка, в течение многих лет не поддавалась количественному анализу. Однако эту проблему можно разрешить методом изотопного разбавления, который в современной химии белка применяли бы еще чаще, если бы хроматография и микробиология, достигшие столь эффективных успехов, не дали нам других методов анализа. Как часто бывает при развитии науки, один непреодолимый барьер был пробит сразу в нескольких местах. [c.264]

Однако только в работе Риттенберга и Фостера [ 5], описавших применение изотопного разбавления для анализа сложных смесей органических соединений, было показано, что метод можно широко использовать в аналитических целях [6]. Эти ученые выяснили также возможность применения метода для установления относительного содержания о- или ь-аминокислот и в соответствующей работе [7] опубликовали результаты определения о- и ь-глутаминовых кислот в ткани злокачественной опухоли (см. также [8]). [c.62]

В литературе приводятся случаи, когда применялись загрязненные аминокислоты. Например, Смит и Грин [35] пользовались для микробиологического определения изолейцимом, который, как было позже обнаружено, содержал аллоизолейцин [36]. Между тем ясно, что наличие примесей в бактериальной среде и меченых аминокислотах может носить серьезные погрешности. Шемин и Фостер [9] подсчитали, что 1 % примеси азотсодержащего соединения яри анализе методом изотопного разбавления вносит ошибку до 9%. [c.215]

Точную аналогию с определением соответствующих элементов с помощью изотопного разбавления представляет использование меченых атомов для определения соответствующих соединений, присутствующих в смеси. Количественное определение содержания данного вещества в смеси обычными методами требует реагента, специфичного для этого вещества. Если такого реагента не существует, то необходимо количественно выделить индивидуал)эНое соединение из смеси. Применение предположительно специфического реагента опасно при наличии в смеси соединений со сходной структурой. Выделение индивидуального соединения обычно ставит нас перед альтернативой выделение малого количества рассматриваемого соединения без примесей либо полное его выделение с примесями чистота и полнота выделения взаимно исключают друг друга. В качестве примера можно привести исследование [1701] гидролизатов белков, содержащих около 24 а-аминокислот, количественное содержание которых должно быть определено для установления структуры белка. При использовании метода изотопного разбавления, представляющего единственный метод полного анализа, необходимо синтезировать каждую из имеющихся а-аминокислот в изотонически обогащенной форме. Например, глицин, содержащий обогащенный азот, образует неразделимую смесь с необогащенным глицином. Выделение малых количеств чистого глицина с последующим измерением отношения в нем позволит точно оценить содержание глицина в смеси. [c.114]

Метод изотопного разбавления может быть применен разнообразными способами для анализа сложных органических смесей. Особенно широкое распространение он начинает получать в биохимии. Работы в этом направлении были выполнены Риттенбергом и Фостером (1940) с применением, стабильных тяжелых изотопов водорода, углерода и азота для определения ряда аминокислот в гидролизатах гемоглобина и альбуминов, а также для определения пальмитиновой кислоты в животных жирах. Для этого-синтезировалось небольшое количество каждого из определяемых соединений, меченное тяжелым изотопом какого-либо из перечисленных элементов, и несколько миллиграммов его прибавлялось к гидролизату. После -этого из смеси изолировалась порция этого же соединения и масспектро- [c.300]

Синтез значительных количеств аминокислот требует большой затраты труда, которой нельзя избежать, но другие стадии метода изотопного разбавления можно упростить. Чистота применяемого соединения может определяться хроматографически использовавшиеся для изолирования методы осаждения можно заменить более новыми (хромотографией [14], ионофорезом [3], фронтальным анализом [47]), применимыми ко всем аминокислотам, а не только к тем из них, которые легче других выделяются при гидролизе и легче кристаллизуются. При обычном способе выделения могут возникать серьезные ошибки вследствие явлений соосаждения [10]. [c.219]

Высокая чувствительность метода обратного изотопного разбавления с радиореагентом, а также селективность, которую обеспечивает применение индикаторного изотопа, позволяют определять микроколичества смесей первичных и вторичных аминов. Эти методы широко применяли в определениях различных аминокислот в биологических образцах [85—88]. В работе [86], в частности, описано использование этих методов для оценки содержания одиннадцати таких соединений в 1 мг белка. Метод с пипсилхлоридом применялся для анализа гистамина, причем в этом анализе проводилось четыре цикла перекристаллизации соответствующего производного с целью его очистки до получения постоянного значения удельной радиоактивности. После проведения этого анализа было предложено [89] применять данный метод для определения любого амина, который дает кристаллический замещенный д-иод-бензолсульфамид. Этим же методом оценивались микрограммные количества 2,4-диоксипиримидина и его 5-метильного производного [90]. Для разделения пипсильных производных в дополнение к бумажной хроматографии применялись жидкофазная колоночная хроматография [91] и тонкослойная хроматография [92]. Хроматографию на бумаге применяли также для оценки радиохимической чистоты реагента [93]. [c.310]

Радиохимические методы имеют чрезвычайно высокую чувствительность и благодаря этому особенно ценны при определениях меркаптогрупп в очень низких концентрациях в образцах биологического происхождения. Особый интерес представляет определение структур типа тиоспиртов в различных белках, в которых эти структуры присутствуют в форме связанной аминокислоты, ь-ци-стеина (ь-2-амино-3-меркаптопропановая кислота). Для проведения анализа низкомолекулярных тиоспиртов можно модифицировать некоторые широко распространенные методы определения меркаптогрупп в белках. В определении макроколичеств меркаптанов можно использовать радиометрическое титрование и прямое изотопное разбавление. Для анализа некоторых ароматических меркаптанов применим, по-видимому, и метод, основанный на изотопном обмене. [c.353]