Аминокислоты, анализ методом изотопного

Белки, см. также биуретовая реакция, аминокислоты анализ методом изотопных производных 7350 аналитическая химия (обзор) 7679 [c.351]

Аминокислотный состав белков. — Анализ гидролизата белков, содержащего до двадцати различных аминокислот (см. табл. 39), является чрезвычайно сложной задачей. Риттенберг (1940) разработал метод изотопного разбавления, согласно которому радиоактивную кислоту определенной удельной активности, например меченую глутаминовую кислоту, добавляют в известном количестве к анализируемой смеси, после чего выделяют глутаминовую кислоту обычным образом. Так как химические свойства природной и меченой кислоты одинаковы, то выделяемое вещество является смесью добавленной аминокислоты и первоначально присутствовавшей в пробе. Количество кислоты в гидролизате вычисляют по изотопному составу выделенной кислоты. Если добавляется рацемическая меченая кислота, то аминокислоты гидролизата перед выделением рацемизуют или же из выделенного рацемата отделяют чистую -форму. Точность анализа не зависит от метода выделения, выхода кислоты или концентрации ее в гидролизате. [c.655]

Первая часть этой задачи решается с помощью процессов гидролиза, происходящих под влиянием энзимов или сильных щелочей и кислот. Особенно хорошие результаты получаются при использовании в качестве гидролизующего агента 6 н. НС1. В этом случае для полного расщепления белковых молекул на аминокис-, лоты необходима обработка белка 6 н. НС1 при температуре 100° С в течение 10—15 ч. Вторая часть этой задачи — анализ образующихся весьма сложных смесей аминокислот — сопряжена с более серьезными трудностями. Обычные методы анализа подобных смесей, связанные с необходимостью количественного выделения всех компонентов смеси, очень трудоемки и приводят к большим погрешностям. Этим объясняются сильные расхождения — в несколько десятков процентов, — при анализе аминокислотного состава различных белков. Метод изотопного разбавления позволяет достигать точности до нескольких десятых долей процента. В этом случае к гидролизату добавляется одна из входящих в его состав аминокислот, меченная углеродом-14. После этого из раствора осаждается некоторое количество определяемой аминокислоты и проводится тщательная очистка ее от примесей. Зная [c.115]

Анализ с помощью метода изотопного разбавления позволяет избежать полного количественного разделения компонентов смеси. Исследуемый белок подвергают гидролизу, после чего в полученный раствор добавляют известное количество одной из аминокислот, предварительно меченной радиоактивным углеродом. (Заметим, что в данном случае молекулы не обязательно должны содержать метку в строго определенном положении). В растворе меченая аминокислота равномерно смешивается с аналогичной немеченой кислотой белка, после чего проводится частичное выделение из раствора исследуемой аминокислоты. Определив активность и массу выделенной порции аминокислоты по формуле (6.13), рассчитывают содержание данной аминокислоты в белке. [c.313]

Предположим, что мы определили аминокислотный состав белкового гидролизата и хотим установить количество содержащегося в нем валина. С этой целью к смеси добавляют небольшое точно взвешенное количество меченого С-валина известной удельной радиоактивности, после чего смесь тщательно перемешивают. Затем с помощью заранее отработанного метода выделяют из гидролизата чистый валин, измеряют удельную радиоактивность разбавленного валина и вычисляют коэффициент разбавления. Предположим, он оказался равным 75. Зная вес меченого валина, первоначально добавленного к гидролизату, можно легко вычислить вес валина, содержащегося в исходном гидролизате. До изобретения аминокислотного анализатора ]Мура и Штейна метод изотопного разбавления широко применялся для анализа аминокислот в белковых гидролизатах. Этот метод и сейчас довольно часто используется в тех случаях, когда необходимо установить, является ли данное соединение предшественником другого соединения в процессе его биосинтеза. Так, например, в последовательности реакций [c.476]

Этот метод может быть, наиример, использован для определения истинного выхода химической реакции в том случае, если выделение веществ затруднительно. Он применим к химическому анализу всех видов—это по существу наиболее известный общий метод,—но особенно хорош он для исследования смесей веществ, близких по своим свойствам. Смесь аминокислот, полученная при гидролизе белка, в течение многих лет не поддавалась количественному анализу. Однако эту проблему можно разрешить методом изотопного разбавления, который в современной химии белка применяли бы еще чаще, если бы хроматография и микробиология, достигшие столь эффективных успехов, не дали нам других методов анализа. Как часто бывает при развитии науки, один непреодолимый барьер был пробит сразу в нескольких местах. [c.264]

На рис. 2.14 показана хроматограмма, полученная при разделении гидролизата инсулина. Авторы работы [324] сняли полные масс-спектры всех компонентов и по характерному для каждой аминокислоты фрагменту определили изотопные отношения. Для количественного анализа они использовали целый набор внутренних стандартов. Этот метод, опробованный на примере инсулина, дает результаты, которые хорошо согласуются с известными данными о составе указанного белка и с результатами аминокислотного анализа, выполненного параллельно по традиционной схеме методом ионообменной хроматографии. [c.88]

В работе [290] дана оценка необходимой степени обогаще ния аминокислот, меченных N, С, 0, Н, при анализе ме тодом СИД Анализировались N ацетил к-пропиловые эфиры аминокислот, которые в случае ХИ (газ реагент метан) образу ют интенсивный пик иона МН+ Результаты исследования сви детельствуют что для определения аминокислот в образце сыворотки крови объемом 100 мкл изотопный избыток N должен быть не менее 0,08% (ат ) В работе [291] было пока зано, что количественный анализ аминокислот, меченных с избытком 0,1 % ( т) можно проводить методом СИД при ГХ—МС ХИ на уровне концентраций О 1 нмоль [c.199]

Однако только в работе Риттенберга и Фостера [ 5], описавших применение изотопного разбавления для анализа сложных смесей органических соединений, было показано, что метод можно широко использовать в аналитических целях [6]. Эти ученые выяснили также возможность применения метода для установления относительного содержания о- или ь-аминокислот и в соответствующей работе [7] опубликовали результаты определения о- и ь-глутаминовых кислот в ткани злокачественной опухоли (см. также [8]). [c.62]

В литературе приводятся случаи, когда применялись загрязненные аминокислоты. Например, Смит и Грин [35] пользовались для микробиологического определения изолейцимом, который, как было позже обнаружено, содержал аллоизолейцин [36]. Между тем ясно, что наличие примесей в бактериальной среде и меченых аминокислотах может носить серьезные погрешности. Шемин и Фостер [9] подсчитали, что 1 % примеси азотсодержащего соединения яри анализе методом изотопного разбавления вносит ошибку до 9%. [c.215]

Аминокислоты Имеется множество методов для выделения и анализа аминокислот в физиологических жидкостях Эти ме тодики используют метод ТСХ, высокоэффективную жидкостную хроматографию, хроматографию на бумаге и газовую хромато графию Основным недостатком анализа аминокислот с по мощью ГХ—МС является необходимость их выделения из био логических жидкостей для последующего анализа в газовой фазе Чаще всего для этой цели применяют ионообменн/ю хро матографию Однако меченые аминокислоты могут потерять изотопную метку при долговременном пребывании в водных растворах при низких значениях pH, что является необходимым условием ионообменной процедуры [c.197]

Точную аналогию с определением соответствующих элементов с помощью изотопного разбавления представляет использование меченых атомов для определения соответствующих соединений, присутствующих в смеси. Количественное определение содержания данного вещества в смеси обычными методами требует реагента, специфичного для этого вещества. Если такого реагента не существует, то необходимо количественно выделить индивидуал)эНое соединение из смеси. Применение предположительно специфического реагента опасно при наличии в смеси соединений со сходной структурой. Выделение индивидуального соединения обычно ставит нас перед альтернативой выделение малого количества рассматриваемого соединения без примесей либо полное его выделение с примесями чистота и полнота выделения взаимно исключают друг друга. В качестве примера можно привести исследование [1701] гидролизатов белков, содержащих около 24 а-аминокислот, количественное содержание которых должно быть определено для установления структуры белка. При использовании метода изотопного разбавления, представляющего единственный метод полного анализа, необходимо синтезировать каждую из имеющихся а-аминокислот в изотонически обогащенной форме. Например, глицин, содержащий обогащенный азот, образует неразделимую смесь с необогащенным глицином. Выделение малых количеств чистого глицина с последующим измерением отношения в нем позволит точно оценить содержание глицина в смеси. [c.114]

Кестон А. и Уденфренд С. Применение метода изотопных производных для анализа белков. В сб. Аминокислоты и белки. М., Изд-во иностр. лит-ры, 1952, с.74— 85. Библ. 5 назв. 1350 [c.280]

Метод изотопного разбавления может быть применен разнообразными способами для анализа сложных органических смесей. Особенно широкое распространение он начинает получать в биохимии. Работы в этом направлении были выполнены Риттенбергом и Фостером (1940) с применением, стабильных тяжелых изотопов водорода, углерода и азота для определения ряда аминокислот в гидролизатах гемоглобина и альбуминов, а также для определения пальмитиновой кислоты в животных жирах. Для этого-синтезировалось небольшое количество каждого из определяемых соединений, меченное тяжелым изотопом какого-либо из перечисленных элементов, и несколько миллиграммов его прибавлялось к гидролизату. После -этого из смеси изолировалась порция этого же соединения и масспектро- [c.300]

Синтез значительных количеств аминокислот требует большой затраты труда, которой нельзя избежать, но другие стадии метода изотопного разбавления можно упростить. Чистота применяемого соединения может определяться хроматографически использовавшиеся для изолирования методы осаждения можно заменить более новыми (хромотографией [14], ионофорезом [3], фронтальным анализом [47]), применимыми ко всем аминокислотам, а не только к тем из них, которые легче других выделяются при гидролизе и легче кристаллизуются. При обычном способе выделения могут возникать серьезные ошибки вследствие явлений соосаждения [10]. [c.219]

Высокая чувствительность метода обратного изотопного разбавления с радиореагентом, а также селективность, которую обеспечивает применение индикаторного изотопа, позволяют определять микроколичества смесей первичных и вторичных аминов. Эти методы широко применяли в определениях различных аминокислот в биологических образцах [85—88]. В работе [86], в частности, описано использование этих методов для оценки содержания одиннадцати таких соединений в 1 мг белка. Метод с пипсилхлоридом применялся для анализа гистамина, причем в этом анализе проводилось четыре цикла перекристаллизации соответствующего производного с целью его очистки до получения постоянного значения удельной радиоактивности. После проведения этого анализа было предложено [89] применять данный метод для определения любого амина, который дает кристаллический замещенный д-иод-бензолсульфамид. Этим же методом оценивались микрограммные количества 2,4-диоксипиримидина и его 5-метильного производного [90]. Для разделения пипсильных производных в дополнение к бумажной хроматографии применялись жидкофазная колоночная хроматография [91] и тонкослойная хроматография [92]. Хроматографию на бумаге применяли также для оценки радиохимической чистоты реагента [93]. [c.310]

Радиохимические методы имеют чрезвычайно высокую чувствительность и благодаря этому особенно ценны при определениях меркаптогрупп в очень низких концентрациях в образцах биологического происхождения. Особый интерес представляет определение структур типа тиоспиртов в различных белках, в которых эти структуры присутствуют в форме связанной аминокислоты, ь-ци-стеина (ь-2-амино-3-меркаптопропановая кислота). Для проведения анализа низкомолекулярных тиоспиртов можно модифицировать некоторые широко распространенные методы определения меркаптогрупп в белках. В определении макроколичеств меркаптанов можно использовать радиометрическое титрование и прямое изотопное разбавление. Для анализа некоторых ароматических меркаптанов применим, по-видимому, и метод, основанный на изотопном обмене. [c.353]

Книга Э. Шталя посвящена детальному описанию метода хроматографии в тонких слоях. В общей части излагаются приемы, аппаратура, сорбенты и некоторые общие методы идентификации. Подробно освещены вопросы теории хроматографии в тонких слоях. Специальный раздел посвящен изотопным методам. Специальная часть состоит из ряда глав, в которых п )иводятся примеры анализов отдельных классов соединений, например алифатических липидов, эфирных масел, бальзамов, смол, витаминов, стероидов, аминокислот, сахаров и т. д. [c.5]

Наряду с несомненными достоинствами необходимо отметить и недостатки книги Блока и Боллинг. Прежде всего следует подчеркнуть, что авторы игнорируют произведения авторитетных советских ученых, основанные на широкой экспериментальной практике особо заслуживают упо.Д1инания работы Н. Д. Прянишникова, Б. И. Збарского, Е. Д. Каверзневой. Во-вторых, в книге не приводятся подробно методы систематического аминокислотного анализа белков, хотя именно эти методы для научной характеристики белков имеют первенствующее значение. Систематический аминокислотный анализ белков освещен в книгах П. С. Садиков— Белковый практикум (Гос. Ленингр. университет, Лгд, 1938) и в 4-м томе Губена 1Методы органической химии (Госхимиздат, 1949 г.), где глава об аминокислотах, полипептидах и дикетопиперазинах переработана М. М. Ботвнник. Недостаточно изложены также некоторые общие методы, нашедшие за последнее время большое распространение, как например, хроматографический и изотопный анализ аминокислотных смесей. [c.5]

В дальнейшем работы Ф. В. Турчина охватывают все более широкий круг вопросов агрономической химии, питания растений и применения удобрений. Особенное значение получают его исследования в области азотного питания. Будучи инпциатором применения в агрохимических исследованиях изотопного метода и широкого использования различных видов спектроскопических методов анализа, Ф. В. Турчин провел классические исследования о поступлении в растения и использовании в них для синтеза аминокислот и белка нитратных, [c.5]

В статьях настоящего сборника представлены основные современные методы анализа белков и аминокислот. Сводные обзоры этих методов даны в статьях П. Кирка Химическое определение белков и особенно А. Мартина и Р. Синджа Аналитическая химия белков . Последующие три статьи Э. Снелла Микробиологические методы анализа аминокислот , А. Тизелиуса Адсорбционный анализ смесей аминокислот и Г. Свенссона Препаративньи электрофорез и ионофорез , специально посвящены трем группам методов, получившим за последние годы особенно большое значение. Необходимо, однако, отметить, что теория хроматографических и электрофоретических методов анализа разобрана в этих статьях недостаточно. Кроме того, в статьях сборника неполно представлены изотопный и спектрофотометрические методы анализа. В статье С. Фокса Конечные аминокислоты в пептидах и белках рассматривается весьма важный для изучения структуры белков, но, как видно из материала статьи, еще очень слабо изученный вопрос о конечных группировках полипептидных цепей. Две заключительные статьи сбор- [c.10]