Нуклеиновые кислоты выделение фенолом

При выделении высокомолекулярных соединений из смесей природного происхождения помимо солей иногда применяют в достаточно высоких концентрациях и иные реактивы. На последующих стадиях выделения бывает весьма желательно вновь удалить их из смеси. В качестве наиболее убедительного примера на фиг. 23 показано удаление фенола из раствора ДНК [10]. Фенол применяют обычно для отделения нуклеиновых кислот от белков. Раньше от фенола [c.140]

Обычно нуклеиновые кислоты в клетках растительных, животных и бактериальных организмов связаны с белками. Для выделения нуклеиновых кислот эта связь разрушается обработкой измельченной ткани ш-процентным раствором хлорида натрия при нагревании или насыщенным раствором фенола при охлаждении. Нуклеиновые кислоты, молекулярная масса которых весьма высока и колеблется [c.612]

Осаждение белков фенолом с целью их удаления (депротеинизация) получило широкое распространение при выделении и очистке нуклеиновых кислот и специфических полисахаридов. К числу последних относятся вещества, от которых зависит принадлежность крови человека к той или иной группе (изоантигены системы ABO). [c.67]

Одни методы разрушения вирусов особенно хорошо приспособлены для получения нативных белков, а другие — для получения интактных нуклеиновых кислот. Во всех наиболее удачных методах выделения белков весь процесс проводят на холоду, но при этом используют растворы с низкими или высокими значениями pH, а при таких значениях pH возникает опасность разрушения нуклеиновых кислот. В отличие от этого при использовании двух наиболее широко распространенных методов выделения инфекционных нуклеиновых кислот, а именно методов с применением детергентов и фенола, которые иногда используют в сочетании друг с другом, разрушение вирусов проводят при нейтральном значении pH, хотя в некоторых случаях при этом необходимо применять повышенные температуры. Инфекционную РНК можно выделить также путем нагревания вируса в солевых растворах. [c.56]

Для выделения используют небольшие объемы ночных культур. Методика включает ферментативную обработку агробактерий с последующим удалением белков из экстракта смесью фенол/хлороформ и концентрирование нуклеиновых кислот путем осаждения этанолом. Описанная ниже методика успешно использовалась для ряда штаммов агробактерий. В следующем разделе 1.12 представлены результаты расщепления суммарной ДНК, агробактерий ферментами рестрикции и примеры анализа по Саузерну последовательностей плазмид, содержащихся в различных мини-препаратах тотальной нуклеиновой кислоты агробактерий. [c.76]

При очистке больших количеств макромолекул, где требуются различные виды фракционирования, часто бывает необходимо удалить соли, сменить буфер, сконцентрировать вещество, удалить вещества типа фенола и детергенты, используемые при выделении и очистке нуклеиновых кислот. Эти процедуры часто занимают много времени (например, осаждение или диализ) и поэтому могут приводить к потерям нестабильных веществ. Гель-проникающая хроматография позволяет быстро решить эти задачи. Например, соли и небольшие молекулы легко могут быть удалены, поскольку они задерживаются всеми гелями. [c.202]

Гельфильтрацией на сефадексе Г-25 очень удобно удалять фенол из препаратов нуклеиновых кислот, получаемых фенольной депротеинизацией [346, 380, 443, 454]. Дри этом сохраняется нативность выделенной нуклеиновой кислоты. Если применяется сефадекс Г-75, то высокополимерная нуклеиновая кислота одновременно освобождается от клеточных нуклеаз [773]. Сефадексы широко используются при очистке вирусов нуклеазами для удаления продуктов гидролиза и самих нуклеаз [51, 454], [c.139]

Сочетание детергента с фенолом для выделения нуклеиновых кислот особенно широкое распространение получило в последнее время. Выделяемые этим методом препараты нуклеиновых кислот отличаются высокой степенью чистоты По всем известным критериям они вполне нативны, хотя и не всегда инфекционны. [c.163]

Особого внимания заслуживает метод выделения нуклеиновых кислот в однофазных системах, где к фенольной фазе добавляют эфир или этанол. Этот метод, по мнению исследователей, позволяет увеличить концентрацию фенола в водной фазе за счет его растворимости в этаноле и эфире. Но главное преимущество заключается в том, что отсутствуют какие-либо гидродинамические воздействия, не требуются повышенные температуры и низкая ионная сила растворителей. [c.163]

В качестве примера рассмотрим фракционирование суммарного препарата нуклеиновых кислот, выделенных из клеток Es heri hia oli с помощью депротеинизации смесью фенол — додецилсульфат натрия. [c.118]

Всякому структурному исследованию ДНК или РНК предшествуют выделение их из клеток, очистка и фракционирование. Поскольку в клетке нуклеиновые кислоты практически всегда находятся в комплексес белками (т. е. в вил, нуклеопротеидов), их выделение сводится в основном к очистке от белков (депротеинизации). Чаще всего нуклеиновые кислоты экстрагируют из гомогенатов клеток или очищенных клеточных органелл смесью фенол — вода В присутствии ионных детергентов (например, додецилсульфата натрия). При этом белки (и ряд других клеточных компонентов) переходят в органическую фазу, а нуклеиновая кислота остается в водной фазе. Из водного раствора ДНК или РНК осаждают спиртом. [c.10]

Собраны сведения о разделении фосфорорганическпх пестицидов, инсектицидов, стероидов, гиббереллинов, пигментов, сложных эфиров, пуринов, сахаров, мономеров и олигомеров в найлоне, тирнмидинов, фенолов, ароматических кислот, спиртов, алкалоидов, аминокислот, карбоновых кислот, смол, карбонильных соединений, амидов, пищевых консервантов, органических галогенпроизвод-ных, иодотирозинов и триглицеридов. Описано также разделение [68, 69] протеинов, ферментов, нуклеиновых кислот, углеводов, пептидов, липидов, гуминовых кислот, сырой нефти, полимеров, например полиэтилена, полибутадиена и ацетата целлюлозы. Гель-хроматография может быть применена для обессоливания растворов, для выделения лития из солевых рассолов [82], а также для удаления низкомолекулярных соединений из растворов высокомолекулярных веществ. [c.550]

Особые преимущества и.меет выделение рибонуклеиновых кислот из гомогенатов тканей млекопитающих, микроорганизмов и вирусов экстракцией фенолом и водой при комнатной температуре, так как при этом белки и дезоксирибонуклеиновые кислоты выпадают в осадок, активность рибонуклеазы подавляется и высокополимерные продукты могут быть получены с хорощими выходами [11—14]. Прямая экстракция дрожжей водным раствором фенола была применена для препаративного получения транспортных РНК [15]. В примененных условиях экстракции высокомолекулярный материал почти не экстрагировался. Комбинирование экстракции с быстрой очисткой РНК на анионитах ЭКТЕОЛА- [16] или ДЭАЭ-целлюлозе [17, 18] дает возможность получать относительно чистую транспортную нуклеиновую кислоту в больших количествах. [c.365]

Из разрушенного смесью фенол — вода нуклеопротеина TMV Анде-рер [55] смог иыде.лить белок TMV (из фенольного раствора). Выделенный белок снова соединялся с нуклеиновой кислотой TMV с образованием кристаллического нуклеопротеина TMV. Это показывает, что белок не денатурируется в жидком феноле необратимо. Кикхефен [56] недавно показал, что различные ферменты — рибонуклеаза, химотрипсин, трипсин, лизоцим и др.— после растворения в жидком феиоле можно количественно выделить сходным способом без потери ими ферментативной активности. Некоторые ферменты даже выдерживают нагревание в фенольном растворе до 80—100°. [c.331]

Кислые полисахариды могут присутствовать в неочищенном препарате липополисахарида, полученном экстракцией смесью вода — фенол. В этом случае на стадии ультрацентрифугирования они вместе с нуклеиновой кислотой остаются в супернатанте. Разделение кислых полисахаридов и нуклеиновых кислот основано на том, что в отличие от комплекса с нуклеиновыми кислотами комплекс цетавлона с кислыми полисахаридами растворим в 0,3 М растворе хлористого натрия. Оба названных комплекса растворяются в 1 М растворе хлористого натрия [12]. Супернатант, содержащий кислые полисахариды и нуклеиновую кислоту, растворяют в таком количестве 0,5 М раствора хлористого натрия, чтобы получился 2%-ный раствор. К этому раствору добавляют 2%-ный водный раствор цетавлона до прекращения выпадения осадка. Осадок комплекса цетавлона с нуклеиновыми кислотами отделяют центрифугированием. При разбавлении супернатанта водой осаждается комплекс цетавлона с кислыми полисахаридами. Этот осадок растворяют в 1 М растворе хлористого натрия (1 г влажного осадка на 100 мл раствора), диализуют 72 ч против воды и содержащий кислые полисахариды раствор лиофилизуют. Модифицированная методика, сходная с приведенной выше, была использована [13] для выделения и очистки кислых полисахаридов из Serratia mar es ens. С помощью этой же самой методики из капсул Е. oli были получены антигены, представляющие собой кислые полисахариды [14]. [c.129]

Наиболее популярным и широко распространенным методом выделения РНК является фенольный метод [102]. Основную особенность этого метода составляет гомогенизация водного раствора вируса в присутствии избытка фенола, который используется в качестве диссоциирующего и денатурирующего агента. Кроме того, фенол служит растворителем для выделяющегося белка, а нуклеиновая кислота остается при этом в водной фазе. [c.57]

Колориметрия и УФ-спектрофотометрия применимы в случае любых РНК. Все РНК имеют одинаковый коэффициент экстинкции при колориметрическом определении. В присутствии белков, полисахаридов и многих других веществ, поглощающих УФ-свет (в том числе фенола, который часто применяется при выделении нуклеиновых кислот), точность УФ-спектрофотометрическо-го анализа снижается. Отклонения от нормального спектра свидетельствуют о загрязнении белком, углеводом или другими соединениями. [c.340]

Выделение недеградированной ядерной РНК [И — 13]. В 1960 г. мы с В. Л. Мантьевой искали пути для выделения ядерной РНК в более или менее нативном состоянии, чтобы изучить ее свойства и выяснить природу. В это время широкое применение приобрел метод выделения нуклеиновых кислот с помощью обработки фенолом. После обработки клеток смесью фенола и воды (или солевого раствора) и разделения фаз центрифугированием РНК переходила в водный слой, а большая часть белков растворялась в феноле (рис. 1). В определенных условиях, [c.9]

Фенольный метод. Метод фенольной экстракции, предложенный в 1952 г. Вестфалем с сотр. [844], открыл большие возможности в исследовании нуклеиновых кислот. Авторы обрабатывали бактерии теплой гомогенной смесью фенола с водой, что приводило к раз делению смеси на две фазы. Бактериальные белки растворялись в фенольной фазе, а нуклеиновые кислоты и полисахаридд — в водной фазе Этот метод был применен Шустером с сотр. [717] для выделения РНК из вируса табачной мозаики, а Гирер и Шрамм, несколько видоизменив методику, выделили инфекционную РНК из ВТМ [362, 363], В основе современных методов получения вирусных нуклеиновых кислот лежит фенольный метод депротеинизации последних авторов. Все предложенные впоследствии модификации этого метода направлены к приспособлению метода для получения нуклеиновых кислот из разнообразных вирусов. [c.160]

В стандартном детергептно-фенольпом методе, применяемом в настоящее время для выделения нуклеиновых кислот из большинства вирусов, экстракцию фенолом обычно проводят при температуре 20°, но для некоторых арбовирусов, например энцефаломиелита лошадей, необходимо увеличить температуру экстрагируемого раствора до 50° [839] Также возмол ны вариации в pH среды. Некоторые авторы используют такие редуцирующие агенты, как 1%-ный меркаптоэтанол, и такие хелатные агенты, как 0,01 или 0,001 % -ный ЭДТА или 0,05 М цитрат натрия. Применение последних оказывается полезным для удаления двухвалентных катионов, таких, как Са++, Mg++ и тяжелых металлов, что способствует образованию хорошо растворимых в водных растворах агрегатов нуклеатов (солей нуклеиновых кислот) [c.163]

Динер и Шнайдер [288] предложили быстрый и удобный однофазный метод выделения РНК из растительных вирусов и ДНК из вируса ЗУ40. Для ВТМ процедура сводится к тому что к 10—20 мг вируса в 1 мл 0,02 М фосфатного буфера, pH 7,0 добавляют 0,5 мл абсолютного этанола, затем смешивают с 1,5 мл раствора, содержащего 1 мл 90%-ного фенола и 0,5 мл этанола при 20 . Смесь выдерживают один час при О и центрифугируют при низкой скорости. Осадок, содержащий РНК, ресуспендируют в фосфатном буфере. Для удаления остаточного фенола РНК дважды осаждают этанолом и центрифугируют при 10 ООО g 10 минут для удаления денатурированного белка. Процесс деградации вирусной частицы до нуклеиновой кислоты занимает около часа и легко контролируется по этапам, В данном случае можно подобрать наименьшую концентрацию фенола при минимальных потерях нуклеиновой кислоты в процессе выделения. [c.164]