Градиент плотности глицерина

Вязкость и плотность растворов глицерина, особенно в области высоких концентраций, нарастают медленнее, чем растворов сахарозы и метризамида, но таким образом, что для растворов глицерина и сахарозы с одинаковой плотностью вязкость оказывается значительно выше у глицерина. Поэтому центрифугирование в градиенте плотности глицерина используют главным образом в тех случаях, когда это диктуется какими-либо дополнительными соображениями, например стабилизирующим действием глицерина на активность некоторых ферментов. [c.209]

Электрофорез в градиенте плотности. В качестве среды используют жидкость, стабилизированную добавлением глицерина, гликолей или сахарозы, создающих градиент плотности. Этой жидкостью, более тяжелой, чем фракционируемый раствор, заполняют внутреннюю трубку стеклянной охлаждаемой колонки. Дно трубки закрыто пористой стеклянной пластинкой. К обоим концам колонки присоединяют два электродных сосуда и проводят электрофорез. [c.145]

Наиболее часто для формирования градиентов плотности используется сахароза, по своим свойствам соответствующая указанным выще требованиям. Кроме того, она дешева и ее раствор обладает определенной вязкостью, способствующей стабилизации зон в то же время эта вязкость не настолько высока, чтобы препятствовать движению заряженных молекул и частиц. Для этой же цели можно применять и другие вещества, например глицерин, этиленгликоль, тяжелую воду и в ограниченном диапазоне концентраций этанол. [c.27]

В последнем замечании содержится намек на то, что опасность выпадения осадка в изоэлектрической точке существует и для самих очищаемых ИЭФ белков. Это действительно так, что иногда заставляет принять особые меры по увеличению растворимости этих белков. Иной раз присутствие сахарозы неблагоприятно сказывается на растворимости белка. В этом случае следует построить градиент плотности путем добавления к раствору амфолитов глицерина (до 60%), этиленгликоля (до 75%) или сорбита (до 50%). Кстати, если фокусирование предполагается вести при рН>9, то сахарозу вообще лучше заменить сорбитом. В щелочной области pH сахароза диссоциирует как слабая кислота и может нарушить характер градиента pH, образуемого амфолитами. [c.72]

Для градиента плотности необходимо выбирать такие вещества, которые доступны в чистом состоянии и не взаимодействуют с веществами и реагентами исследуемых растворов и суспензий. На практике часто используют сахарозу, фиколл и глицерин. [c.106]

Первые две процедуры позволяют избавиться от фрагментов тканей, обрывков клеток и крупных ядерных органелл (ядер, митохондрий). Супернатант после второго центрифугирования фильтруют и центрифугируют 60 мин при 145 000 Полученый осадок ресуспендируют в среде гомогенизации и центрифугируют 120 мин при 95 000 g в ступенчатом (25 %, 30, 40 %) градиенте плотности сахарозы, содержащем 5 мМ имидазола-НС1 (рН=7,2). Образовавшиеся белковые зоны, локализованные в верхних слоях растворов сахарозы, отбирают и разводят в 20—25 раз средой гомогенизирования и центрифугируют с целью концентрирования при 145 ООО g в течение 60 мин (ротор РПУ-35). Супернатант отбрасывают, а осадок ресуспендируют в среде хранения, содержащей 25 % (по объему) глицерина, [c.220]

Тот же принцип использован в кристаллизаторе, который состоит из вертикальной трубки, содержащей две несмешивающиеся жидкости, поддерживаемые при различных температурах двумя раздельными нагревателями, что создает резкий температурный градиент на границе раздела [38, 50]. Простой кристаллизатор этого типа представлен на рис. 11. Для твердых веществ, плавящихся ниже 80°, верхней фазой может быть минеральное масло, а нижней — вода. Для веществ, плавящихся при температурах до 225°, верхней фазой может быть силиконовое масло, а нижней — глицерин, причем в случае твердых тел с плотностью меньшей, чем плотность нижней фазы, трубка должна быть нагружена. В таких двухфазных банях можно получить очень резкие температурные градиенты. Если верхняя фаза (силиконовое масло) находится при 230°, то температурный градиент вблизи границы раздела составляет около 50° на 1 см. Положение градиента строго постоянно, и с подходящими трубками можно получить монокристаллы при скорости движения 1—3 мм час. [c.175]

Из приведенных в предыдущей главе данных следует, что сахароза и глицерин непригодны для создания необходимого в этом случае градиента. Плавучая плотность нуклеиновых кислот выше, чем самых концентрированных растворов сахарозы [c.241]

Было проведено сравнительное изучение седиментационных свойств РНК вируса саркомы Рауса и седимеп-тационных свойств РНК других вирусов. Наряду с центрифугированием в градиенте плотности глицерина после обработки диметилсульфоксидом или после нагревания была использована и новая методика — непосредственная обработка 99%-ным раствором диметилсульфоксида, которая гарантирует полную денатурацию нуклеиновых кислот и, таким образом, дает возможность выявить такие разрывы цепей и более длинные пропуски которые [c.114]

Некоторые исследователи сообщают о потере инфек-ционности РНК при центрифугировании в сахарозном градиенте при нейтральном pH [280, 622]. В подобных случаях удобнее пользоваться градиентом плотности глицерина (10 30%). Понс [662] предположил, что сахароза содер жит следы рибонуклеазы, Френкель-Конрат и Сингер [330 действительно и ока за л и, что причиной потери инфекционности РНК вируса табачной мозаики при очистке в сахарозном градиенте является присутствие рибонуклеазы. Ддя подавления активности рибонуклеазы можно применять додецилсульфат натрия в концентрации 0,5% при [c.178]

ИЗОЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЕ, метод разделения и анализа амфотерных в-в, гл. обр. белков, в электрич. поле в среде с изменяющимся в определ. направлении pH. В-ва при зтом смещаются к катоду или аноду до тех пор, пока каждое из них не достигнет зоны, pH к-рой совпадает с его изоэлектрич. точкой, и не сконцентрируется в ней ( фокусирование ). Градиент pH создают, помещая в электрич. поле смесь амфолитов с широким набором изоэлектрич. точек, напр, смесь полиаминов, замещенных в разл. степени карбоксиалкильными группами (т. н. амфолинов). Для стабилизации градиента разделение проводят в вертикальных колонках с градиентом плотности, наполненных сахарозой или глицерином, либо в слоях гелей (полиакриламида, се-фадексов). Метод обладает высоким разрешением и примен. для выделения и очистки от десятков миллиграммов до неск. граммов белков, идентификации (неск. мкг) и анализа их сложных смесей и т. д. [c.216]

Градиент концентрации геля создают аналогично градиенту плотности сахарозы. Трубки заполняют раствором снизу. В конце смешивания применяют растворы сахарозы или глицерина, вытесняющие оставшуюся смесь компонентов геля в трубки. Затем гель оставляют для полимеризации. Линейность градиента можно проверить разными способами 1) гель, раз1резакный на части, высуш ивают и взвешивают 2) один из растворов окрашивают бромфеноловьгм синим и определяют концентрацию красителя в градиенте 3) наблюдают за перемещением и остановкой узких границ, образующихся при электрофоретическом разделении некоторых неоднородных смесей (например, фрагментированной ДНК) [51]. [c.104]

Среда для ИЭФ в градиенте плотности. Для стабилизации зон при ИЭФ чаще всего используют градиент плотности сахарозы, но применяют также и другие вещества, такие, как 1,2-пропапд иол (этиленгликоль [9]), глицерин, маннит, сорбит, декстран и фиколл. Глицерин имеет некоторые преимущества перед сахарозой в области pH выше 10, где она частично диссоциирует и искажает определяемые во фракциях величины pH [I344J. Обычно работают с линейными градиентами плотности, однако для повышения их емкости иногда создают и нелинейные градиенты [1259]. [c.143]

Для создания градиентов плотности среды при зонально-скоростном центрифугировании нашли применение растворы следующих веществ сахарозы, глицерина, метризамида ( Ме1п8ат1-с1е ), фиколла ( р1соП ) и перколла ( РегсоИ ). Первые два вещества общеизвестны, поэтому приведем краткие характеристики трех остальных. [c.206]

В начале главы были указаны причины относительно редкого использования глицерина для создания градиентов плотности при зонально-скоростном центрифугировании. Главным его недостатком является более высокая вязкость растворов по сравнению с растворами сахарозы той же плотности. Однако недавно повышенная вязкость концентрированных растворов глицерина была использована для фракционирования относительно тяжелых оЛигонуклеосом. Хроматин после обработки его микрококковой нуклеазой фракционировали в градиенте 7,6— 76% (по объему) глицерина при 130 ООО g в течение 16 ч. Профиль олигонуклеосом от моно- до пентамеров равномерно распределялся по этому градиенту [Rennie, 1979]. [c.239]

В методе САФ тонкий слой забуференного раствора фермента в начале опыта (при скорости вращения ротора 1000— 2000 об/мин) наслаивается на однородный раствор субстратов-в том же буфере, но с добавленным низкомолекулярным веществом. Стабилизация достигается также с помощью градиента плотности, но в этом случае он образуется уже после наслоения благодаря диффузии низкомолекулярного вещества в слой — полосу с ферментом. Для эффективного протекания этого процесса самогенерации градиента в качестве низкомолекулярных веществ применяют нейтральную соль, D2O, глицерин и т. п., но не сахарозу, у которой для таких опытов недостаточно велик коэффициент диффузии. [c.177]

Колонка (150X10 мм) была уравновешена стандартным буферным раствором, в котором проводилась хроматография [0,01 М трис (pH 8,0), 10- М ЭДТА, 10- М дитиоэритротиол, 5%-ный глицерин], и 0,25 М хлоридом калия. Элюирование адсорбированного белка осуществляли линейным градиентом концентрации хлорида калия (600 мл, 0,25 1,25 моль/л) в стандартном буферном растворе. 95 мл раствора РНК-полимеразы наносились на колонку. Постоянная скорость потока при загрузке колонки и элюировании поддерживалась перистальтическим насосом. Фракции по 10 мл собраны и испытаны на РНК-полимеразную активность с использованием ДНК тимуса теленка (/) и ДНК Т4 (,2) в качестве матриц. Общий выход РНК-полимеразной активности с колонки составлял 80%. Сплошная линия — оптическая плотность при 280 нм, пунктир — концентрация хлорида калия. [c.271]

Материал, полученный одним из описанных выше методов, обычно контаминирован клеточными компонентами. Однако в тех случаях, когда высокая степень очистки не обязательна (например, для постановки RIA или ELISA), его можно использовать уже на этой стадии. Тем не менее для большинства исследований необходима дальнейшая очистка вируса с помощью зонально-скоростного или изопикнического центрифугирования в градиенте. При скоростном центрифугировании положение вируса в градиенте определяется его коэффициентом седиментации, а при изопикническом — плавучей плотностью. Для достижения максимальной степени очистки вирусных частиц от примесей изменение концентрации образующего градиент вещества должно быть плавным в то же время на промежуточных стадиях очистки нередко используют ступенчатые градиенты. В некоторых случаях принципы скоростного и изопикнического центрифугирования совмещаются примером может служить использование градиентов глицерина — тартрата калия [14]. В таких градиентах концентрация тартрата калия возрастает в направлении дна пробирки, достигая плотности, соответствующей плавучей плотности вируса концентрация глицерина, наоборот, максимальна на мениске, что препятствует продвижению медленно седиментирующего материала в направлении дна. Все типы градиентов обычно центрифугируют в бакет-роторах, но в случае изопикнических градиентов такие же или даже лучшие результаты можно получить в угловых или вертикальных роторах с помощью приспособлений для медленного разгона и остановки, обеспечивающих переориентацию градиента без перемешивания. При очистке конкретного вируса часто приходится проводить целую серию последовательных стадий центрифугирования в разных типах градиентов, чтобы добиться нужной степени очистки. [c.100]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология