Градиенты для разделения пептидов

РАЗДЕЛЕНИЕ ПЕПТИДОВ В ГРАДИЕНТАХ АЦЕТОНИТРИЛА И СПИРТОВ [c.201]

Слабоосновные пептиды фракционируют в буферных растворах с pH 6,5—7,0, т. е. в той области, где аминогруппа заряжена частично. В этой области pH амберлит ШС-50 обладает высокой буферной емкостью, что препятствует элюированию со сменой pH. Поэтому фракционирование проводят в градиенте ионной силы, но при постоянном значении pH. Постоянства pH достигают применением фосфатных буферных растворов градиент ионной силы задают путем повышения концентрации фосфата или хлорида натрия. Разделение пептидов происходит в данном случае благодаря сочетанию двух факторов ионного [c.408]

При разделении смесей, содержащих ДНФ-аминокислоты и ДНФ-пептиды, система создания градиента состоит из двух частей. Первый градиент создают, помещая в сосуды 1—6 по 150 мл системы 2, 2, 2, 10, 10, 15% грет-амилового спирта— -гептан. Температура в колонке 20 °С, скорость подачи 150 мл/ч. В этих условиях вымываются все ДНФ-аминокислоты вплоть до серина. Второй градиент создают, помещая в сосуды 1 н 2 по 200 мл системы 15% грег-амилового спирта—и-гептан, в сосуды 3 и 4 — по 183 мл 50% метилэтилкетона в н-гептане и в сосуды 5—9 чистый метилэтилкетон (168 мл). В этих условиях вымываются остальные ДНФ-аминокислоты и пептиды. [c.371]

Элюирование проводили в градиенте хлорида натрия на фоне исходного буфера. Общие выводы относительно эффективности разделения в градиенте этого типа, а также рекомендации относительно оптимальных условий разделения (с указанием объема колонки и наклона градиента) той или иной смеси пептидов можно найти в работе 44]. [c.415]

В газовой хроматографии градиентная элюция осуществляется в результате непрерывного изменения температуры в колонке, что осуществляется в результате перемещения кольцевой печки вдоль колонки. Решающую роль градиентная элюция играет в хроматографическом разделении полимеров [5]. Правда, количественные закономерности этого процесса иные, так как он основан на сочетании градиентного изменения состава раствора и наличия градиента температуры в колонке. Подобный процесс относится к особому типу хроматографии — к осадочной хроматографии. Смесь полимеров, находящаяся в верхней части колонки в виде осадка, растворяется в результате введения хорошего растворителя и переносится вниз по колонке, где снова выпадает в осадок, попадая в более холодную часть колонки. Многократное повторение, актов растворения и осаждения является лучшим методом хроматографического разделения гидрофобных высоко-полимеров. Вместе с тем этот метод применим и для разделения смеси пептидов. [c.115]

Рис. 7-50. а - разделение смеси пептидов на капиллярной колонке с применением градиентного элюирования. Колонка 1 мм (Внутр. диам.) х 35 см неподвижная фаза зорбакс BP-ODS (7,5 мкм) подвижная фаза ацетонитрил/водный раствор, содержащий 0,1% фосфорной кислоты и 10 ммоль/л дигидрофосфата калия (5/95) градиент 10 - 100% в течение 36 мин обьемная скорость 80 мкл/мин детектор УФ, 214 нм о м пробы 5 мкл. [c.208]

Докладывалось об изучении по-13, 15] в ходе этой работы удалось разделить с высоким разрешением такие белки, как миоглобин, цитохром с, лизоцим, используя 0,1 М фосфат (pH 2,1, суммарное содержание электролитов 0,2 моль/л) и градиент концентрации ацетонитрила. Для оптимального разделения оказалось необходимым использовать и солевые эффекты, и низкие pH большую роль сыграла концентрация органического растворителя. В кислых буферах (pH 2) боковые цепи Asp и Glu остаются незаряженными, что увеличивает гидрофобность полипептида. Добавление солей приводит к подавлению ионных взаимодействий с носителем. Ацетонитрил как органический растворитель и фосфат как солевой фон использованы неслучайно это дает возможность регистрировать в элюате пептиды по поглощению пептидной связи при 215 нм. [c.209]

Разделение пептидов на колонке Mi roPak АХ-10 осуществляли с помощью линейного градиента концентрации соли 25—100% 0,01 М триэтиламмонийацетатного буфера (pH 6) в смеси с ацетонитрилом. Очень кислые пептиды элюировали дополнительно 0,04 М НСООН при 60°. Использование летучих элюентов облегчало дальнейший анализ состава пептидов [ Dizdaroglu et aL, 1982]. [c.300]

Хроматография гидролизатов проводилась при +4° С на колонке с фосфоцеллюлозой 2,4x25 см со скоростью 60 мл/час. Химотрипсиновый гидролизат лизоцима фракционировался с возрастающим градиентом pH аммонийно-ацетатного буфера от 3,4 до 9,0 и возрастанием концентрации от 0,02 до 0,3 М. Пепсиновый гидролизат фракционировался с возрастанием pH пиридин-ацетат-ного буфера от 3,9 до 5,4 и возрастанием концентрации от 0,05 до 0,45 М. Фракционирование по такой схеме дает очень хорошее групповое разделение пептидов (до 3—6 пептидов в одном пике). Сопоставление таких групп, полученных действием разных ферментов, позволяет составить полную аминокислотную последовательность исходного белка. [c.185]

ТФУ и ГФМК используются в анализе аминокислотной последовательности по Эдману и доступны в высокоочищенном состоянии. Буферы на основе этих кислот летучи и прозрачны при 215 нм. Описано применение ТФУ и ГФМК для разделения пептидов [1, 30]. Эти кислоты идеальны как растворители для выделения пептидов типичным примером служит фракционирование триптического гидролизата цитохрома с на колонке с сорбентом Vyda С18 в градиенте концентрации ацетонитрила (рис. 6.10). [c.217]

При разделении относительно крупных бромциановых пептидов ОС-, р- и 7-цепей глобина человека 0,1 %-ный раствор ТФУ, помимо своей роли в осуществлении ион-парной хроматографии, оказался очень полезен как прекрасный растворитель для пептидов, в частности гидрофобных. Кроме того, раствор ТФУ прозрачен вплоть до А, = 216 нм и легко удаляется лиофилизацией. Фракционирование вели на колонке Li lirosorb RP-8 (0,46 X 50 см). Использование сорбента с меньшей, чем в рассмотренных выше примерах, гидрофобностью обусловлено большими размерами пептидов. Колонку уравновешивали 0,1%-ньш водным раствором ТФУ, впрыскивали в нее 100 мкл смеси пептидов и вели элюцию линейным градиентом концентрации изопропанола (от нуля со скоростью нарастания 1,6% в минуту) в течение 1 ч при температуре 28 и скорости подачи элюента 0,7 мл/мин. Профиль элюции показан на рис. 96 (сплошная линия). Пептиды длиной 32, 43 и 64 аминокислотных остатка хорошо отделились друг от друга [Mahoney, Hermod-son, 1980]. [c.204]

Триптические пептиды а-и р-цепей гемоглобина хроматографировали в градиенте пиридин-ацетатных буферов [39]. При этом хроматографическое поведение пептидов в целом напоминало их поведение при разделении на смоле дауэкс-50, хотя в профилях элюирования наблюдались несомненные различия. Поэтому те пептиды, которые элюируются на смоле дауэкс-50 в одной зоне, можно разделить на фосфоцеллюлозе, и наоборот. На основании этой работы можно сделать определенные выводы относительно связи между хроматографическим поведением и структурой пептидов. За редким исключением, более длинные, отрицательно заряженные пептиды элюируются в меньшем объеме по сравнению с короткими, положительно заряженными пептидами. Пептиды, содержащие более шести аминокислотных остатков и несущие слабый отрицательный заряд (—2), элюируются при рН<4,7 короткие пептиды, включающие менее семи остатков и в целом заряженные положительно, элюируются при рн > 4,7. В работах [38, 39] отмечено также удерживание фосфоцеллюлозой гистидинсодержащих пептидов. [c.412]

Оптимальное разрешение белков и пептидов может быть достигнуто при более пологом градиенте, однако концентрация белка должна быть не менее 10 М. На практике концентрация белка обычно составляет не более 10 М. Как было показано при разделении легких цепей иммуноглобулинов на SE-сефа-дексе и QAE-сефадексе, в этих условиях разрешение выше при крутом градиенте [21]. [c.436]

В разд. 4.4 была рассмотрена матричная хроматография [51], применяемая для исследования взаимодействий между пептидами и олигодезокситимидиловой кислотой. Шотт и др. [50] применили также иммобилизованные олигонуклеотиды для избирательного разделения свободных нуклеотидов по механизму образования пар оснований. Комплементарные олигонуклеотиды в подвижной фазе избирательно сорбируются на иммобилизованной матрице, если хроматографию проводить в условиях, необходимых для образования пар оснований. Десорбция осуществляется с помощью градиента температуры. Матричная хроматография позволяет изучать специфичность олигонуклеотидов в образовании нуклеотидных пар и взаимодействие олигонуклеотидов с пептидами. [c.133]

Кинетика обмена в ионообменной хроматографии аминокислот и пептидов сильно зависит от температуры. Воспроизводимый контроль температуры колонки требуется для того, чтобы получить воспроизводимые последовательность и время выхода пиков, необходимые для идентификации аминокислот или пептидов и для разделения близких по свойствам соединений. Эти контролируемые условия обычно достигаются путем циркулирования воды из термостата по рубашке колонки. Термостат снабжается контрольным термометром. Емкость термостата, мощность нагрева и скорость подачи воды насосом должны быть достаточными для поддержания температуры в рубашке колонки с точностью 0,5 °С в диапазоне 30—70 °С. Одной из тонкостей программирования температуры является скорость повышения температуры при переходе от одной температуры к другой, как это предписывается многими методиками анализа. В тех случаях, когда по методике для данного прибора требуется смена температуры, которая происходит в течение 20 мин, любой другой температурный градиент может привести к нежелательным результатам. Поэтому неудивительно, что некоторые методики не удается воспроизвести на сходных приборах, если режимы изменения температур не одинаковы. Целесообразно включать градиентное термостатирование в основную кoн tpyкцию анализатора. [c.28]

Примеры применения. Таких примеров пока немного. Уже в первых опытах Свенсону с сотрудниками удалось получить хорошее разделение красителей в градиенте метанола. Имеются работы по разделению белков сыворотки крови, причем удалось впервые обнаружить дополнительную фракцию альбумина, движущуюся впереди основного пика. Б работе [18] разделялись меченные С и пептиды и нук.тгеиновые кислоты [c.78]

Хроматография гидролизата полилизина, содержащего набор всех олигопептидов начиная с лизина, на карбоксиметилцеллюлозе с градиентом концентрации Na l позволила получить разделение первых 20 членов гомологического ряда. В этом случае, как оказалось, пептиды появляются на выходе колонки в порядке возрастания молекулярного веса, номер пика соответствует числу остатков лизина в пептиде. При этом имеет место линейная зависимость между числом остатков лизина в пептиде и молярностью КаС1, требующейся для элюции этого пептида. Очень важно тщательное соблюдение условий разделения (постоянство объема [c.182]

Особым направлением является хроматография гетеропептидов на ионообменных целлюлозах. Трудность проблемы здесь состоит в том, что пептиды могут быть построены из самых разнообразных аминокислот, так что в каждом частном случае приходится подбирать особые условия разделения, специфичные только для данной системы. И если при разделении основных или кислых полиаминокислот достаточно было градиентного изменения концентрации нейтральной соли, то в случае гетеропептидов приходится применять также и градиент pH, что в основном и приводит к разделению. [c.184]

Простая, но изящная методика высоковольтного электрофореза развилась на основе работы Виланда [1], вышедшей в 1948 г. В ряде случаев при помощи этой методики удается получить удовлетворительные результаты при разделении аминокислот или пептидов в условиях традиента потенциала 5—20 в1см, однако для разделения сложной смеси этих веществ такие условия оказываются недостаточными. Высокие скорости диффузии веществ с низким молекулярным весом ограничивают аналитические возможности электрофореза на бумаге поэтому исследователи начали проводить опыты в условиях градиента потенциала 50—200 в см. Четкая очерченность зон при таких градиентах потенциала видна на фиг. 21 и 22. [c.40]

На фиг. 19 (полоса Е) показано положение на электрофореграм-ме ряда небольших пептидов (по 5—15 мкг) относительно аспарагиновой кислоты после разделения при pH 2,0 в градиенте потенциала 90 в/см. В большинстве случаев небольшие пептиды, полученные из более длинных (по 6—10 остатков), обычно можно разделить четко и быстро однократным электрофорезом. Так, для подтверждения предполагаемой структуры р-меланотроиного гормона Гаррис и Роос [17] подвергли пептиды, полученные из ферментативных гидролизатов этого гормона, дальнейшему частичному гидролизу кислотой. Электрофореграммы фрагментов, полученных при кислотном гидролизе двух пептидов, приведены на фиг. 19 (полосы Ж и 3). Электрофорез проводили в следующих условиях для пептида Т1 пиридин — уксусная кислота — вода (10 0,4 90, по объему), рН6,5, 35—40 в/см, 2 час, а для пептида Т2(3) пиридин — уксусная кислота — вода (1 10 189), pH 3,5, 35—40 в/см, 2 час. Теплообменником служил толуол. [c.54]

Смолу дауэкс-1 Х2 переводят в ацетатную форму последовательной обработкой 1 н. раствором едкого натра, 1 н. раствором соляной кислоты, 1 н. раствором едкого натра и 50%-ным раствором уксусной кислоты, причем после пропускания каждого реактива смолу промывают водой. На колонку 0,9 X 150 см, содержащую эту смолу и работающую при 40°, можно наносить до 30 мкмолей (100 мг) смеси пептидов если подлежащий разделению препарат содержит в основном один пептид, эта величина должна быть несколько меньше. Градиенты элюирующих растворов устанавливают с помощью устройства типа вариграда элюирующие растворы прокачивают через колонку соответствующим насосом. (Подробнее о приготовлении элюирующих растворов см. работу [28].) [c.117]

В этом примере показано, как можно с помощью ГПХ разделить по молекулярной массе продукты бромиианового гидролиза тяжелых цепей Н-2 (рис. 8,Л ом. гл. 10). На рис. 8,5 представлены результаты калибровки колонки стандартами с известной молекулярной массой при линейном градиенте элюции. Как видно, данная колонка лучше всего пригодна для разделения низкомолекулярных компонентов (с мол. массой менее 25 000—30000). Имеются, однако, колонки, которые больше подходят для разделения высокомолекулярных белков. Как и в предыдущем примере, для дальнейшей очистки отдельных пептидов можно провести повторную хроматографию на той же колонке. [c.117]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология