ДНК-зонды геномные

Зонды для скрининга геномной библиотеки можно получить по крайней мере двумя способами. Во-первых, можно использовать клонированную ДНК близкородственного организма (гетерологичный зонд). В этом случае условия гибридизации нужно подбирать таким образом, чтобы она могла происходить при существенном расхождении между нуклеотидными последовательностями зонда и искомой ДНК это позволяет решить проблемы, связанные с заведомым различием между ДНК - источником зонда и исследуемой ДНК. Во-вторых, зонд можно получить методом химического синтеза, основываясь на известной аминокислотной последовательности белкового продукта искомого гена. [c.67]

Первым этапом анализа ДНК является экстракция ДНК из любой ткани, содержащей ядерные клетки с последующей ее очисткой. Далее геномную ДНК анализируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или подвергают расщеплению ферментами рестрикции — рестриктаза-ми, распознающими специфические последовательности нуклеотидов и гидролизующими ДНК на ряд фрагментов рестрикции . Последние могут быть разделены методом электрофореза или подвергнуты денатурации нагреванием до однонитевых фрагментов, которые затем переносят на нейлоновый фильтр или нитроцеллюлозную мембрану. Таким образом сохраняется пространственное расположение фрагментов ДНК относительно друг друга. Полученный материал анализируется с помощью ДНК-зонда, представляющего собой фрагмент одноцепочечной ДНК, как правило, помеченный радиоактивным изотопом Р и содержащий специфическую последовательность оснований, комплементарную участку ДНК, который необходимо обнаружить. В качестве зонда можно использовать как нативную ДНК, специфичную гену (геномные зонды), так и синтетическую ДНК, полученную на основе РНК гена (комплементарная ДНК). Если анализируемая последовательность присутствует во фрагментах рестрикции, то зонд гибридизуется с ними, что можно обнаружить с помощью авторадиографии. [c.528]

Титр вируса в культуральной среде инфицированных клеток можно определить с помощью целого ряда методик, в основе которых лежат физические, биохимические или биологические методы анализа. Наибольшее распространение получил способ, заключающийся в количественном определении вирусной геномной РНК в культуральной среде с помощью гибридизации с меченным ДНК-зондом. Эту стандартную процедуру дот-блот-гибридизационного анализа проводят после концентрирования препарата вируса, как описано в табл. 9.4. Количественное определение достигается путем сравнения интенсивности полученного гибридизационного сигнала с интенсивностью контрольных сигналов гибридизации точно титрованного вируса (разд. 9.6.1.3) или известных количеств РНК, или ДНК, нанесенных на фильтр. Используя разные ДНК-зонды, можно оценить концентрацию индивидуальых компонентов в вирусном препарате и непосредственно определить, содержит ли вирус интересующие нас последовательности. [c.297]

Прогулка по хромосоме . Метод гибридизации полезно использовать, например, для анализа очень протяженного гена. При этом с помощью подходящего зонда из геномной библиотеки ДНК извлекается первоначально какая-то часть такого гена. Нуклеотидная последовательность этой части гена будет, как правило, длиннее зонда, и ее концы будут перекрываться с другими фрагментами данного гена в этой библиотеке, т. е. будут по крайней мере частично гибридизоваться с ними. Свободные концы этих фрагментов будут гибридизоваться со следующими и т.д., пока весь структурный ген не будет полностью идентифицирован серией перекрываю- [c.127]

Если оценивать вероятность Р гибридизации зонда длины W в геномной библиотеке длины п, полагая, что зонд гибридизуется при наличии не менее Ь совпадений, то можно воспользоваться формулой [c.74]

Иммунологический скрининг В отсутствие ДНК-зонда для скрининга геномной библиотеки можно использовать другие методы. Например, если клонированный ген экспрессируется, то его продукт - весь белок или его часть - можно обнаружить иммунологиче- [c.67]

Рис. 4.13. Скрининг библиотеки геномной ДНК с применением меченого зонда. Клетки после трансформации высевают на твердую питательную среду, обеспечивающую рост только трансформированных клеток. 1. Переносят клетки из каждой выросшей колонии на твердую подложку (например, нитроцеллюлозный или найлоновый фильр) так, чтобы их расположение соответствовало таковому на чащке. 2. Клетки лизируют, высвободившуюся ДНК подвергают денатурации и депротеинизации и фиксируют на фильтре. 3. На фильтр наносят меченый ДНК-зонд и проводят гибридизацию. Смывают с фильтра негибридизовавшийся зонд и проводят радиоавтографию с тем чтобы определить, какие клетки содержат меченый ДНК-зонд. 4. Идентифицируют на чашке колонии, содержащие искомую ДНК (положительный гибридизационный сигнал), отбирают из них материал и культивируют.

Зонды получают разными способами. Один из них состоит в следующем. ДНК патогенного микроорганизма расщепляют с помощью рестрицирующей эндонуклеазы и клонируют в плазмидном векторе. Затем проводят скрининг рекомбинантных плазмид с использованием геномной ДНК как патогенного, так и непатогенного штаммов. Те плазмиды, которые содержат последовательности, гибридизующиеся только с ДНК патогенного штамма, составляют основу видоспецифичных зондов. После этого проводят ряд дополнительных гибридизаций с ДНК, выделенными из различных организмов, чтобы удостовериться, что потенциальные зонды не дают с ними перекрестной гибридизации. Для определения чувствительности метода каждый из зондов проверяют также на модельных образцах, в том числе и на смешанных культурах. [c.188]

В судебной медицине все более широкое применение находит метод геномной дактилоскопии, основанный на том, что ДНК каждого человека образует уникальный набор гибриди-зационных полос. При этом в качестве зондов обычно используют минисателлитные ДНК человека, которые не кодируют никаких белков и отличаются высокой вариабельностью. [c.202]

Идентифицированный ген образования клубеньков использовали в качестве зонда для обнаружения фланкирующих его участков хромосомной ДНК R. meliloti в геномной библиотеке. [c.318]

Чтобы идентифицировать полиморфные STR-локусы, нужно прежде всего провести скрининг геномной библиотеки человека, содержащей вставки небольшого размера (примерно 1000 п. н.), используя подходящий олигонуклеотидный зонд. Для идентификации клонированных (СА),,-повторов обычно используют зонд, состоящий из 15 СА-элементов. Каждую позитивную вставку секвенируют, чтобы установить длину СА-повтора и нуклеотидные последовательности фланкирующих его участков. Чтобы определить, являются ли фланкирующие последовательности однокопийны- [c.454]

В том случае, если в каждом праймере содержатся рестрикционные сайты, клонируют ПЦР-продукт, несущий пойманный экзон, и используют последний в качестве зонда для скрининга кДНК-библиотеки. Зная нуклеотидную последовательность пойманного экзона, предпринимают поиск гомологичных ему последовательностей в базе данных. Если есть основания полагать, что пойманный экзон с большой вероятностью является частью гена данного заболевания, то характеризуют и секвенируют геномные клоны, охватывающие место расположения данного гена, и исследуют образцы ДНК больных и здоровых индивидов с целью выявления мутаций. Поскольку мутации, ответственные за патологию, не всегда бывают равномерно распределены по всем экзонам, чем больше размер сканированной кодирующей области предполагаемого гена, тем больше вероятность обнаружения мутации. [c.476]

Internet Line). Они созданы исходя из некоторых характерных для экзона особенностей. Одна из них - ожидаемая нуклеотидная последовательность кодирующей области. Если лаборатория оснащена оборудованием для широкомасштабного секвенирования, можно секвенировать геномные клоны, охватывающие область расположения искомого гена, и провести компьютерную обработку полученных данных с целью выявления экзонов. Нуклеотидную последовательность предполагаемого экзона можно использовать для поиска гомологичных ей последовательностей в генной базе данных или синтезировать на ее основе олигонуклеотидный зонд для скрининга кДНК-библиотеки. Наконец, как и в случае других методов идентификации экзонов в геномных клонах, необходимо доказать, что предполагаемый экзон является частью гена-мишени. [c.476]

Позиционно-кандидатное картирование состоит в определении хромосомной локализации гена болезни, продукт которого неизвестен, и последующем анализе современных генетических и транскрипционных карт, с тем чтобы выявить кодирующие последовательности (гены, внутригенные EST), находящиеся в этом же районе (рис. 20.30). Весьма вероятно, что одна из этих последовательностей и окажется геном данного заболевания. Если какой-либо из генов-канди-датов охарактеризован, можно провести его мутационный анализ. Как альтернативу можно использовать кандидатные EST в качестве зондов, отобрать с их помощью геномный клон и секвенировать его, а затем также провести му- [c.476]

Для идентификации нужного гена человека используют четыре метода. В первом из них, функциональном картировании, на основе данных о генном продукте синтезируют зонды для скрининга кДНК-библиотеки. Положительный кДНК-клон, содержащий кодирующую область гена-мишени, используют для отбора геномных клонов и характеристики гена в целом. Второй подход, кандидатное картирование, основывается на выборе генов, которые по имеющимся [c.480]

Скрининг библиотек. После того как радиоактивный зонд получен, просматривают геномную библиотеку или библиотеку кДНК для идентификации бактериальных колоний, содержащих плазмиду с последовательностью, комплементарной зонду и, следовательно, соответствующей анализируемому белку. [c.46]

Анализ ДНК методом блот-гибридизации используется не только при скрининге кДНК и геномных библиотек, но и для анализа геномной ДНК. При помощи этого метода можно определить присутствие определенной последовательности ДНК в геноме (например, присутствие чужеродного гена в геноме трансгенных растений, копийность гена, анализировать изменения в нуклеотидной последовательности гена и т. д.). Анализ ДНК методом блот-гибридизации основан на идентификации определенных фрагментов ДНК путем их гибридизации со специфическими мечеными зондами. Он состоит из следующих этапов 1) рестрикция ДНК 2) перенос рестрицированных фрагментов из геля на нейлоновый фильтр и их иммобилизация 3) гибридизация с меченым зондом. [c.47]

Прямое выделение фрагментов генома, соответствующих зонду, сопряжено с практическими трудностями, и для выделения отдельных генов используют эффективный метод с обратным порядком стадий, когда вначале проводят клонирование генома. Затем проводят отбор клона(ов), содержащего специфическую последовательность. Векторы, несущие ДНК, полученную из генома, называют клонами геномной или хромосомной ДНК (в отличие от клонов кДНК, являющихся копиями мРНК). [c.243]

Как осуществляют селекцию определенного клона геномной ДНК из библиотеки Один из методов называется гибридизацией колоний. Последовательность операций этого метода приведена на рис. 19.8. Бактериальные колонии, несунще химерные векторы, лизируют на нитроцеллюлозных фильтрах. Затем их ДНК денатурируют и фиксируют на фильтре. Фильтр гибридизуют с радиоактивным зондом (обычно это клонированная кДНК), соответствующим интересующей исследователя последовательности. Все колонии, с которыми гибридизуется зонд, при авторадиографии выявляются в виде темных пятен. После этого соответствующие химерные векторы могут быть выделены из исходной библиотеки. [c.244]

Для гибридизации с зондом достаточно, чтобы клоны геномной ДНК содержали только часть комплементарной ему последовательности (обычно считают, что минимальный размер клонированной последовательности должен составлять около 50 п. н.). На практике, когда эукариотический ген имеет значительный размер, при создании библиотеки он может оказаться фрагментированным, так что разные участки гена окажутся в разных клонах, гибрвдизующихся с зондом. Полную нуклеотидную последовательность, соответствующую зонду, может не содержать ни один из клонов геномной ДНК. В этом случае необходимо реконструировать исходную геномную последовательность, используя наличие перекрываний индивидуальных фрагментов, которые, по всей видимости, имеют разные концы. [c.244]

В конечном итоге сравнение нуклеотидных последовательностей гена и клона кДНК точно выявляет местоположение и размер промежуточных последовательностей. Такой анализ на уровне последовательностей необходим, прежде чем мы сможем быть уверенными в том, что выявлены все участки гена. Действительно, в ряде случаев было неожиданно обнаружено, что геномная нуклеотидная последовательность содержит дополнительный короткий кодирующий участок. Когда кодирующий участок имеет длину менее 50 п. н., он может не гибридизоваться с кДНК-зондом и поэтому, попадая внутрь находящейся справа или слева от гена промежуточной последовательности, остаться незамеченным. [c.252]

Рис. 5-85. Использование перекрывающихся фрагментов для картирования интересующего нас гена путем прогулки по хромосоме . Для того чтобы сократить время прогулки , наиболее пригодны геномные библиотеки, содержащие очень крупные клонированные молекулы ДНК. Зохвдом для каждого следующего клона служит короткий Р-фрагмент ДНК одного из концов предыдущего идентифицированного клона. Если, например, используется правый конец, то и перемещение происходит вправо , как в случае, представленном на этом рисунке. Короткий концевой фрагмент удобен в качестве зонда еще и потому, что это снижает вероятность присутствия в зогще повторяющейся последовательности ДНК, которая могла бы гибридизоваться со многими клонами из разных частей генома и тем самым прервать прогулку .

Появившиеся в последнее время методы позволяют составлять подробные карты очень больших геномов. Есть две категории карт 1. Физические карты, основывающиеся на строении молекул ДНК, составляющих каждую хромосому. Сюда относятся рестрикционные карты и систематизированные библиотеки клонов геномной ДНК. 2. Карты генетического сцепления их строят, основываясь на частоте совместной передачи потомству двух или нескольких признаков - генетических маркеров, различных у отца и матери и приписываемых определенному участку хромосомы. В качестве маркеров издавна принято использовать те гены, экспрессия которых обнаруживается по их эффекту (таковы, в частности, гены, вызывающие генетические болезни, например мышечную дистрофию). Разработанные сравнительно недавно новые методы с применением рекомбинантной ДНК дали возможность использовать в качестве генетических маркеров короткие последовательности ДНК, содержащие один из сайтов рестрикции и различающиеся у отдельных индивидуумов, такие последовательности особенно удобны для генетического картирования, потому что под действием рестрикционной нуклеазы возникают фрагменты, различающиеся по своей длине, и этот полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) легко может быть выявлен блот-анализом по Саузерну с помощью подходящего ДНК-зонда (рис. 5-90). [c.342]

ДНК мышей, несущ,их в качестве трансгена фрагмент ДНК вируса SV-40, который не обнаруживает гомологии с мышиной ДНК. Исследовали потомков (А, В и С) гетерозиготных по трансгену родителей (их гетерозиготность считается генетически установленной). Два одинаковых фильтра с ДНК из тканей хвоста гибридизовали один — с радиоактивно меченной ДНК SV-40, чтобы выявить трансген, а другой — с радиоактивно меченной мышиной последовательностью, в данном случае с геном -fos. Одинаковая интенсивность гибридизационного сигнала с зондом -fos для всех трех образцов указывает на то, что количество ДНК на фильтре в каждом случае одинаково. Тогда гибридизация с зондом SV-40 позволяет сделать вывод, что мышь А имеет в геноме больше трансгенных последовательностей, чем особи В и С. Количественное денситометрическое сканирование или просчитывание радиоактивных пятен на сцин-тилляционном счетчике показало, что в геномной ДНК А содержится в два раза больше вирусной ДНК, чем в ДНК В и С, и, следовательно, особь А можно считать потенциально гомозиготной по трансгену. Этот вывод подтверждается результатами генетического анализа. Мышь А (это самец) скрестили с нормальной самкой F1 и ДНК родившихся детенышей исследовали с помощью слот-анализа. Поскольку все 10 мышей оказались гетерозиготными по трансгену, их отец (мышь А) гомозиготен. [c.349]

Зонд (проба). Молекула, используемая для выявления специфических фрагментов ДНК, РНК или белка при блот-анализе. (Например, при скрининге геномных библиотек). Зондами могут служить молекулы кДНК, синтетические олигонуклеотиды или специфические антитела. [c.51]

Однако важнее, что этот метод позволяет препаративно разделять хромосомы, и при наличии специфических зондов исследовать структуру и функцию отдельных генов становится относительно просто. В этом случае ген можно локализовать в хромосоме с помощью гибридизации in situ, размножить его ДНК путем клонирования и секвенировать. Можно исследовать таким же образом и генетический материал некодирующих участков гена. Основой для такого рода исследований являются геномные библиотеки ДНК. Однако их неудобство состоит в том, что обычно трудно или невозможно отобрать из огромного количества фрагментов интересующие нас последовательности. Кроме того, изучение распределения ДНК по различным хромосомам нередко само по себе является важным предметом исследования. Для такого рода работ необходимы библиотеки ДНК отдельных хромосом или даже их отдельных фраг.ментов. [c.131]

Был синтезирован олигонуклеотидный зонд (длиной в 36 нуклеотидов), соответствующий одному из пептидов, полученных после обработки фактора VIII трипсином. Этот очень короткий ДНК-зонд использовали для скринирования ) -фаговой библиотеки геномной ДНК человека с кариотипом 49,XXXXY. Следовательно, высокая концентрация Х-специфических фрагментов ДНК была получена не при помощи сортировки хромосом, как описано ранее (разд. 2.3.2.5), а благодаря природной аномалии. Клоны, выявленные с помощью гибридизации с ДНК-зондом (разд. 2.3), имели перекрывающиеся концы, благодаря чему оказалось возможной первичная идентификация какой-то части природного гена (рис. 2.91). [c.135]

Смотреть страницы где упоминается термин ДНК-зонды геномные: [c.102] [c.103] [c.188] [c.205] [c.298] [c.469] [c.470] [c.470] [c.480] [c.549] [c.46] [c.504] [c.59] [c.333] [c.335] [c.261] [c.43] [c.74] [c.207] [c.133] [c.138] [c.43]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология