ДЭАЭ-целлюлоза в ОН форм

Рис. 4-46. Три типа матриксов, используемых для хроматографии. При ионообменной хроматографии (А) нерастворимый матрикс содержит ионы, задерживающие молекулы с противоположным зарядом. Для разделения молекул используются следующие матриксы диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) - заряжена положительно карбоксиметилцеллюлоза (КМ-целлюлоза) и фосфоцеллюлоза - заряжены отрицательно. Силы взаимодействия между молекулами в растворе и ионообменником определяются ионной силой и pH элюирующего раствора, которые для достижения эффективного разделения можно варьировать определенным образом (как на рис. 4-47). При хроматографии по методу гель-фильтрапии (Б) матрикс инертен, но содержит поры. Низкомолекулярные соединения проникают внутрь частиц матрикса. Оказавшись при этом в относительно большем объеме, они проходят через колонку медленнее. В качестве матрикса можно использовать зерна поперечно-сшитого полисахарида (декстран или агароза). Поскольку в продаже имеются полисахариды с самым различным размером пор, их можно использовать для фракционирования молекул с молекулярной массой от 500 до 5 х 10 дальтон. При аффинной хроматографии (В) используется нерастворимый матрикс, ковалентно связанный со специфичными лигандами (антителами или субстратом ферментов), которые присоединяют определенный белок. Связываемые иммобилизованным субстратом молекулы фермента можно элюировать концентрированными растворами субстрата в свободной форме, а молекулы, связанные с иммобилизованными антителами, можно элюировать за счет диссоциации комплекса антитело антиген концентрированными растворами соли или растворами низкого или высокого pH. Однократная хроматография на такой колонке позволяет

Подготовка сорбента. Около 10 г ДЭАЭ-целлюлозы обрабатывают и переводят в ОН--форму (с. 109). [c.111]

Подготовка ДЭАЭ-целлюлозы для хроматографии в С1 "-форме производится так же, как указано выше, но уравновешивание колонки, растворение фракционируемого материала и элюирование осуществляют буферными растворами, содержащими 8М мочевину. В качестве стартового буферного раствора в данном случае используют буферный раствор трис-НС pH 8, содержащий 0,05 М С1 и 8 М мочевины. Чтобы предотвратить агрегацию и ассоциацию молекул фракционируемого материала в присутствии мочевины, к буферному раствору добавляют 0,1% додецилсульфата натрия. В полученном растворе, содержащем оба детергента (мочевину и додецил-сульфат натрия), растворяют фракционируемый материал, который диализуют против того же раствора в течение 24 ч. [c.207]

ХРОМАТОГРАФИЯ НА КОЛОНКЕ С ДЭАЭ-ЦЕЛЛЮЛОЗОЙ В ОН -ФОРМЕ [c.204]

Выбор буферного раствора определяется исключительно природой фракционируемого материала. Если хлориды не вступают с последним в реакцию, то рекомендуется проводить хроматографию а ДЭАЭ-целлюлозе в СГ-форме. [c.205]

ДЭАЭ-ЦЕЛЛЮЛОЗА В С --ФОРМЕ [c.205]

Адсорбция полисахаридов на ДЭАЭ-целлюлозе весьма зависит от строения разделяемых соединений, поэтому нельзя дать общей методики, применимой для всех полисахаридов. Необходим предварительный подбор условий наилучшего разделения для каждого полисахаридного препарата, подлежащего фракционированию. Необходимо отметить, что в общем случае адсорбции на ДЭАЭ-целлюлозе способствует увеличение числа кислотных групп в молекуле полисахарида. В гомологичной серии линейных полисахаридов вещества с низким молекулярным весом удерживаются менее прочно, чем высокомолекулярные [8, 20]. Далее, следует ожидать, что форма молекулы полисахарида также влияет на адсорбцию например, при фракционировании растворимого крахмала и декстринов линейные компоненты удерживаются прочнее разветвленных [5]. При применении ДЭАЭ-целлюлозы в боратной форме могут проявляться дополнительные влияния на процесс разделения. [c.269]

Поэтому до настоящего времени не нашли широкого распространения в области полисахаридов такие виды хроматографии, как распределительная и адсорбционная (отдельные примеры см." ). Более успешным оказалось применение ионообменной хроматографии для разделения кислых и даже нейтральных полисахаридов. Ионообменниками служат обы.ч,но аниониты, полученные модификацией целлюлозы, например ДЭАЭ-целлюлоза. Для элюирования полисахаридов с колонок используют растворы солей или буферные растворы разной концентрации прочно удерживаемые полисахариды элюируют разбавленными растворами щелочей. Таким споссбом легко удается отделить кислые полисахариды от нейтральных, например, пектиновую кислоту от сопутствующего ара-бинана или сульфированные полисахариды водорослей от крахмалоподобных примесей в ряде случаев при таком способе разделения удается освободиться от примесей белка. Нейтральные полисахариды можно разделить, применив ДЭ.ЛЭ-целлюлозу в боратной форме, при вымывании боратным буфером . Описано также успешное применение ЭКТЕОЛА- [c.486]

После этого колонка с ДЭАЭ-целлюлозой в основной форме готова к употреблению. Чтобы перевести целлюлозу в фосфатную форму, колонку промывают 8—10 удерживаемыми объемами 0,5 М буферного раствора фосфата натрия с нужным pH. Избыток фосфата удаляют промыванием дистиллированной водой. Колонку в боратной форме готовят, промывая 8—10 объемами 0,5 М раствора бората натрия, а избыток бората отмывают дистиллированной водой. [c.270]

ДЭАЭ-целлюлозу (в хлоридной форме), предварительно промытую 0,01 М фосфатным буфером (pH 7,0), [c.14]

Навеску порошка сорбента суспендируют в 50-кратном и более объеме дистиллированной воды, перемешивают и оставляют набухать на ночь. Слой жидкости над ионообменником декантируют, снова заливают дистиллированной водой, перемешивают и через 2—2,5 ч верхний слой жидкости декантируют вместе с неосевшими мелкими частицами. К оставшемуся осадку приливают 50-кратный объем 0,5 н. NaOH, тщательно перемешивают и через час ионит фильтруют через воронку Бухнера Осадок на воронке промывают водой до pH 7,0. Затем ионит перемешивают в 50-кратном объеме 0,5 н. НС1 и через 30—60 мин (время обработки ионита кислотой не должно быть большим) отмывают дистиллированной водой примерно до pH 5,0. На следующем этапе в случае анионитов, например ДЭАЭ-целлюлозы, сорбент повторной обработкой щелочью переводят в ОН -форму. Для этого его суспендируют в 50-кратном объеме 0,5 н. NaOH, перемешивают и через час отмывают дистиллированной водой до pH воды. В случае катионитов, например КМ-целлюлозы, сорбент повторной обработкой кислотой переводят в Н+-форму. Для этого его суспендируют в 50-кратном избытке [c.109]

Нейтральные полисахариды адсорбируются лишь в щелочной среде ДЭАЭ-целлюлозой в основной форме, где они приобретают слабый отрицательный заряд. Элюирование в этом случае проводят щелочными растворами возрастающих концентраций. Нейтральные полисахариды можно фракционировать, также используя свойство полисахаридов давать отрицательно заряженные боратные комплексы. В этом случае используют ДЭАЭ-целлюлозу в боратной форме. Полисахариды, образующие боратные комплексы, задерживаются на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой и элюируются из колонки растворами бората возрастающей концентрации. Нейтральные по-лисариды, не образующие боратных комплексов, не задерживаются ДЭАЭ-целлюлозой. [c.46]

Колонка для хроматографического разделения белков предварительно подготавливается следующим образом 0,5 г ДЭАЭ-целлюлозы в ОН -форме смешивается в стаканчике с фосфатным буферным раствором при pH 7,6. Неосаждающиеся частицы целлюлозы удаляются декантацией. Целлюлоза в виде кашицы вносится в колонку диаметром 0,8 см. Над осевшей целлюлозой в колонке должен быть слой жидкости высотой 2—3 см. [c.130]

Ионообменные целлюлозы как слабые кислоты или основания являются плохими сорбентами авлинокислот. КМ-целлюлоза в Н -форме задерживает яхшхь диаминокарбоновые кислоты, а ДЭАЭ-целлюлоза в ОН -форме — только моноаминодикарбоновые кислоты [37]. Большая часть аминокислот (14—15 из 18 ь общей смеси) разделяется при двухмерной хроматографии на ДЭАЭ-бумаге в ОН -форме. Смесь аминокислот сначала проявляют 0,02 М раствором ацетата натрия с pH 7,5, При этом аминокислоты разделяются в последовательности значений рК их аминогрупп. Затем проявляют насыщенным водой т-крезолом в атмосфере аммиака [35]. [c.214]

Соли и мочевину из фракций удаляют, разбавляя их в 5 раз водой и хроматографируя на ДЭАЭ-целлюлозе (карбонатная форма). Колош у промывают 0,01 М карбонатом аммошш до полного удаления С1 -ионов и затем элюируют нуклеотиды 2 М раствором (NH4)2 Oз. Карбонат аммония удаляют, упаривая раствор досуха в вакууме при температуре бани 30° (повторяют 2 раза). Упаривание следует проводить осторожно, чтобы предохранить олигонуклеотиды от щелочного гидролиза. [c.101]

Белки эффективно концентрируются с помощью электрофореза в ПААГ [63, 196, 276, 277, 382] или изотахофореза [283J. Применение электрофоретической процедуры для концентрирования макромолекул путем осаждения [308] или извлечения белков из неионных растворов с использованием мембран [3] может осложняться необратимой сорбцией белка иа мембране. С этой проблемой сталкиваются также и при работе с жидкими мембранами [384, 385] (см. дальше). Белки из разбавленного раствора (100—800 нг/мл) были выделены осаждением после введения радиоактивной метки с помощью [ Н]-1-фторо-2,4-ди-иитробензола [280]. Для снятия белков с ДЭАЭ-целлюлозы в высококонцентрированной форме использовался карбоксиметил-декстран [367]. [c.246]

Антигены, Антигены, используемые для иммунизации, должны быть очень хорошо очищены, для чего можно использовать метод иммуноаффинной хроматографии или классические методы . Чистая GGT из почек быка может быть выделена солюбилизацией фермента в присутствии дезоксихолата натрия с последующей обработкой -бутанолом, фракционированием сульфатом аммония и хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе [27]. Полученный после разделения на сефарозе 6В препарат GGT подвергается протеолитическому гидролизу бромелаином, и полученная GGT (легкая форма) очищается электрофорезом в полиакриламидном геле [28]. Чистая GGT из почек крысы (фермент П1) может быть получена [29] подобным методом. [c.153]

Подготовка колонки с ДЭАЭ-целлюлозой. Колонку размером 22X250 мм заполняют 10 г ДЭАЭ-целЛюлозы (ОН--форма). Через колонку пропускают 1 М ацетатный буфер (pH 6,0) до полного замещения 0Н на СН3СОО-. Избыток ацетата удаляют, промывая колонку 0,5 л дистиллированной воды, затем пропускают через колонку 200 мл 1 % раствора 2-меркаптоэтанола. [c.82]

Различные буферы, используемые для ионного обмена, приведены в табл. 4.6. Концентрация ионной и нейтральной форм буфера должна составлять по меньшей мере 5 мМ. Таким o6tpa-зом, при использовании трис-С на ДЭАЭ-целлюлозе буфер должен соде ржать не менее 40 мМ триса, pH которого доведен до значения его р7(а с помощью НС1. Удобнее всего готовить буфер из 10 мМ НС1, доводя его pH до нужного значения незаряженным основанием (в данном случае трисом) преимущество этого способа состоит в том, что ионная сила точно известна (0,01 Н-трис+-С1 ). При работе с катионообменниками делают наобо рот, а именно 10 мМ КОН т1итруют до нужного значения pH с помощью МЭС. Следует помнить о влиянии температуры на величины р/Са (разд. 6.1), особенно если буфер готовят при комнатной температуре, а используют на холоде. К сожалению, при воспроизведении опубликованных методик редко бывает ясно, в каких условиях доводили pH до нужной величины — на холоде или при комнатной температуре. [c.121]

Большую ценность в методическом отношении представляют работы Т. И. Тихоненко [105, 110], который применил для колоночной хроматографии в препаративных целях ДЭАЭ-целлюлозу в волокнистой форме, отличающейся высокой проходимостью матрицы для концентрированных белковых растворов. Одновременно была решена проб-лема обработки больших количеств вируссодержащего материала (до 6—25 л), концентрирования и очистки вирусов до степени, пригодной ддя работы на ультрацентрифуге, В дальнейшем подобная форма ионообменников (волокнистые ДЭАЭ- и ТЭАЭ-целлюлозы) была успешно применена для очистки и фракционирования/Бируса Сендай [9, 48, 49], вируса гриппа [54, 64, 89] и классической чумы птиц [124, 125] [c.122]

Клетки эукариот и в самом деле содержат множественные формы РНК-полимеразы (рис. 15-15). Из зародышей морского ежа выделили ядра, разрушили их и содержимое нанесли на колонку ДЭАЭ-сефадекса (принцип разделения компонентов тот же, что и в случае ДЭЛЭ-целлюлозы) и элюировали растворами соли разной концентрации (использовали сульфат аммония). В каждой фракции определяли содержание белка по поглощению света с длиной волпы 2800 А (белки поглощают свет с такой длиной волны), а также активность РНК-полимеразы. При этом наблюдали три больших пика активности фермента. Когда фракции, входящие в каждый пик, объединили, вновь нанесли на колонку и элюировали, то во всех случаях образовывался только один пнк. Следовательно, взаимного превращепия не было. Отсюда можно заключить, что существуют по крайней мере три основные формы полимеразы. В ядрах клеток печени крысы также обнаружено три пика. Один из них связан с ядрышком. Возможно, эта полимераза ответственна за синтез рРНК. Другие две формы находятся в ядер-ном соке. Опи также могут транскрибировать какие-то специфические участки генома. [c.289]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология