Реакции Эдмана Метод Эдмана

Метод Эдмана последовательной деградации пептидов и белков основан на реакции фенилизотиоцианата с концевой аминогруппой в щелочной среде, которая приводит сначала к образованию тиомочевинной метки концевой аминокислоты, последняя при действии СРзСООН отщепляется, в конечном счете, в виде замещенного фенилтиогидантоина, после чего полипептидная цепь белка укорачивается на один аминокислотный остаток. Далее этот процесс повторяется вновь [c.94]

Эдмана реакция (деградация белков но Эдману) - метод отщепления от белка и идентификации К-концевой аминокислоты. Действующим реагентом в реакции является фенилизотиоцианат. [c.530]

Многократное повторение реакции Эдмана, таким образом, позволяет определить N-концевую аминокислотную последовательность изучаемого пептида. Этот метод имеет исключительно большое значение при определении последовательности пептидов, изолированных из ферментативных гидролизатов, и, следовательно, при выяснении первичной структуры белков с высоким молекулярным весом. [c.283]

Наибольшее внимание следует уделять разработке химических аспектов метода в этом отношении большие методические возможности и гибкость ТФ-анализа до сих пор мало используются. Для повышения чувствительности анализа необходимо добиваться снижения уровня химического фона и повышения эффективности отщепления аминокислот (выход как в первом цикле отщепления, так и постадийные выходы в последующих циклах). На основе более глубокого понимания всех проходящих химических реакций (как основных, так и побочных) необходимо систематически пересматривать условия проведения реакции Эдмана и разрабатывать другие методы отщепления. [c.439]

Используя аналогичную систему ТСХ для идентификации ФТГ-АК в последовательных циклах секвенирования полипептидов по методу Эдмана (вручную), Рид и Мак-Кэй столкнулись со следующей трудностью иа месте ФТГ-Arg в каждом цикле выходил некий, также гасящий флюоресценцию фона побочный продукт реакции. Они описали метод детектирования истинного пятна ФТГ-Arg путем дополнительной обработки пластинки смесью (1 1) 0,02%-ного раствора фенантренхинона и 10%-ного раствора NaOH в 60%-ном этаноле. После такой обработки только пятна ФТГ-АК прн освещении длинноволновым УФ-светом давали интенсивную желто-зеленую флюоресценцию иа слегка флюоресцирующем голубоватом фоне пластинки [Reed, Ma Kay, 1978]. [c.485]

Реагенты, используемые для этой реакции, указаны в табл. 5. Все эти реагенты в мягких условиях (pH 8,5, низкая температура) образуют производные, отличающиеся друг от Но скорости циклизации и растворимости в кислотных рёагёйтах, вызывающих циклизацию. Указанные реагенты успеШНо рйменялись для исследования простых пептидов, но только ф йлизотиоцианатный метод Эдмана нашел широкое [c.239]

Определение N-кoнцeвoй группы проводят по методу Эдмана (1950 г.), который основан на реакции Ы-концевой группы полипептида с фенилизо-тиоцианатом. [c.521]

Метод Эдмана, разработанный для М-концевых аминокислот (аминокислот со свободной МНз-группой), основан на реакции полипептидов или белков с фенилизотиоцианатом, образующим фенилтиомочевину по концевой МНз-группе. При последующем гидролизе отщепляется фенилгидантоин, а остальная молекула не затрагивается [c.509]

Другим химическим методом определения К-концевых групп является метод Эдмана — реакция с фенилизотиоцианатом. При этом происходит перегруппировка и расщепление с образованием фенилтиогидантоина К-концевой аминокислоты [50]. Для данного способа была разработана стандартная методика [57] и выяснен механизм реакции [51]. Фенилтиокарбамильный пептид, полз ча-ющийся при этой реакции, быстро расщепляется в кислой среде с образованием 5-тиазолинона N-кoнцeвoй аминокислоты и остатка пептида. 5-Тиазолинон затем быстро гидролизуется до фенилтио- [c.403]

Исследуя реакцию взаимодействия метилизотиоцианата с белками, авторы показали, что при большом избытке реагента (60 мкл) образуется продукт, затрудняюпщй газохроматографическое определение. При анализе бычьего инсулина после первого цикла его расщепления по методу Эдмана на хроматограмме были идентифицированы пики производных глицина и фенилаланина, после второго цикла — пики производных второй пары аминокислот изолейцина и валина. Пик производного глицина может быть экранирован пиком производного валина. [c.34]

В результате ферментативного воздействия, определяли последовательно после каждого отщепления Ы-концевого остатка по методу Эдмана (см. гл. 6). При изучении гемоглобина (Брауницер был удачно применен последовательный гидролиз белка разными про-теолитическими ферментами. В этом случае на белок действовали трипсином, а затем полученные пептиды гидролизовали пепсином, специфичность которого значительно повышали, ограничивая время реакции. Методические трудности, связанные с фракционированием сложных гидролизатов и определением полной структурной формулы белка, были преодолены в результате упорного труда нескольких групп ученых. Мы теперь знаем полную аминокислотную последовательность инсулина, глюкагона, рибонуклеазы, гемоглобина, белка вируса табачной мозаики, а также кортикотропина и других пептидных гормонов приближаются к завершению работы по установлению строения папаина, лизоцима, химотрипсиногена, трипсииогена, цитохрома с успешно продвигается изучение некоторых других белков. Изучение последовательности аминокислот проводилось на частичных кислотных гидролизатах или на гидролизатах, полученных при действии различных протеолитических ферментов. Чисто химические методы избирательного расщепления пептидных цепей не имели до сих пор значительного успеха, и эта область остается еще нерешенной задачей пептидно химии. [c.117]

Второй метод исследования К-концов (метод Эдмана) называется фенилтиогидантоинным методом. Используется реакция с фенилизотиоцианатом [c.23]

Первоначально в методе Эдмана тиогидантоины подвергали щелочному гидролизу для освобождения аминокислот, которые идентифицировали хроматографией на бумаге [129]. Аргинин и триптофан давали по два пятна, что затрудняло идентификацию. Сёквист [131] преодолел эту трудность, применив непосредственную хроматографию фТГ на бумаге и обнаруживая зоны реакцией с иодом и азидом [132]. Эдман и Сёквист [133] разработали количественный метод элюирования пятен ФТГ с последующим определением их ультрафиолетового поглощения при 270 ммк. [c.154]

Выходы па стадиях классического ( ручного ) метода Эдмана обычно ниже, чем при использовании автоматических приборов, главным образом вследствие невозможности полного исключения кислорода из реакционной среды и менее эффектив-]плх промывок водной фазы. Поскольку реакция расщепления 1 рифтороуксусной кислотой обратима [21] (рис. 10.1), присутствие тиазолинонов, неполностью экстрагированных на преды- [c.343]

Схема разделения и очистки пептидов, описываемая ниже (включающая гельфильтрацию, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе или дауэксе-50, высоковольтный электрофорез и хроматографию на бумаге), применима к белкам средней молекуляр-1ЮЙ массы (до 40 000). Крупные фрагмеггты, плохо разделяющиеся на бумаге и элюирующиеся с нее, первоначально отделяют гель-фильтрацией, а основную часть пептидов после фракцио- шрования на ионообменнике очищают окончательно хроматографией на бумаге. Однако эта схема применима далеко ие ко всем типам гидролизатов белков. Например, мембран11ые белки плохо расщепляются ферментами с высокой специфичностью, такими, как трипсин или стафилококковая протеаза гидрофобные пептиды склонны к образованию агрегатов при гель-фильтрации, осаждаются на ионообменных колонках и экстрагируются в охлаждающую среду при высоковольтном электрофорезе на бумаге и в органическую фазу при промывках в реакции Эдмана. Оптимальная схема анализа структуры мембранных белков включает их фрагментацию с помощью химических методов на небольшое число крупных пептидов, разделение в денатурирующих условиях на полиакриламидных гелях и определение аминокислотной последовательности автоматическим методом после присоединения пептида к твердой матрице. Альтернативный вариант основан на использовании протеаз с низкой специфичностью (таких, как пепсин или эластаза). При этом образуется значительное число коротких пептидов, которые [c.352]

Твердофазный метод позволяет использовать для анализа аминокислотной последовательности подходы, отличающиеся от реакции Эдмана. Многие реагенты, пригодные для проведения альтернативных химических реакций, нельзя применять в ЖФ-методе из-за того, что простой экстракцией часто невозможно полностью удалить избыток реагентов и продукты побочн1)1х реакций. [c.452]

С-концевое отщепление. Предложен ряд методов последовательного химического расщепления по карбоксильному концу молекулы пептида (гл. 18). Первые попытки в этом направлении были предприняты еще до описания реакции Эдмана, но они не смогли составить конкуренцию последней. В перспективном, тщательно изученном методе [98] С-концевой карбоксил пептида реагирует с тиоцианатом аммония в уксусном ангидриде полученный при этом циклический пептидилтиоги-дантоин обрабатывается кислотой (или ацетогидроксаматом) продуктами последней реакции являются тиогидантоин С-концевого остатка и пептид, укороченный на одну С-концевую аминокислоту. В исходной методике каждый цикл отщепления включал длительные и трудоемкие стадии разделения и сушки. Удавалось отщепить только 2—6 остатков. Однако в связи с развитием ТФ-метода с этим подходом связаны новые надеж- [c.454]

Другой метод определения концевых групп, предложенный Эдма-ном (1950), включает избирательное отщепление N -концевых аминокислотных остатков. При реакции белка с фенилизотиоцианатом образуется соответствующее фенилтиокарбамильное производное I, которое расщепляется хлористым водородом до фенилтиогидантоина II и модифицированного белка. Наконец, щелочной гидролиз фенилтиогидантои-на приводит к выделению свободной концевой аминокислоты ПГ. [c.675]

Френкель-Конрат при отщеплении N-концевых аминокислот по способу Эдмана (см. стр. 171). Этим методом было подтверждено наличие С-концевого аланина у альбумина сыворотки крови лошади. Очень часто вследствие побочных реакций получают низкие выходы 2-тиогидантоинов по-видимому, идентификацию отщепляемой аминокислоты лучше осуществить путем сопоставления аминокислотного состава исходного и укороченного пептида или белка (т. е. по разности). Фокс и др. показали [51], что аминокислоты лизоцима (кроме С-концевого остатка) не разрушаются при обработке по методу Шлака и Кампфа точный аминокислотный анализ после кислотного гидролиза показал потерю 1 остатка лейцина на 1 моль лизоцима (мол. вес 14 700). [c.210]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология