Фенилизотиоцианат, реакция с аминокислотами

Рис. 1.6. Реакция фенилизотиоцианата с а-аминокислотами

Следует отметить, что в кислых условиях (т. е. безводная трифторуксусиая кислота) гидроксил (протонированный) становится уходящей группой аналогично ведет себя и амин (амидная связь). Так, реакция фенилизотиоцианата с белком — важный метод определения Ы-концевой аминокислоты и последующего определения первичной структуры белка. Напомнив, что мономерные составляющие белка соединены амидными (так называемыми пептидными связями), покажем это на примере простого дипептида глицилаланина. [c.53]

Метод Эдмана последовательной деградации пептидов и белков основан на реакции фенилизотиоцианата с концевой аминогруппой в щелочной среде, которая приводит сначала к образованию тиомочевинной метки концевой аминокислоты, последняя при действии СРзСООН отщепляется, в конечном счете, в виде замещенного фенилтиогидантоина, после чего полипептидная цепь белка укорачивается на один аминокислотный остаток. Далее этот процесс повторяется вновь [c.94]

Эдмана реакция (деградация белков но Эдману) - метод отщепления от белка и идентификации К-концевой аминокислоты. Действующим реагентом в реакции является фенилизотиоцианат. [c.530]

По оригинальной прописи Эдмана [43] 0,5—1 г аминокислоты растворяют в 25 мл водного пиридина (1 1) в закупоренной пробирке. С помощью 1 н. гидроокиси натрия доводят pH до 9,0, затем раствор помещают в водяную баню при 40° и добавляют при перемешивании 1,2 мл фенилизотиоцианата. В ходе реакции (продолжительность ее около 30 мин), добавляя щелочь, поддерживают pH около 9,0. Затем реакционную смесь повторно экстрагируют бензолом для удаления избытка реагента и пиридина. Реакцию считают законченной, когда прекращается потребление щелочи. Для осаждения ФТК-аминокислоты добавляют небольшой избыток 1 н. соляной кислоты. ФТК-аминокислоту отфильтровывают и нагревают осадок с 30 мл 1 н. соляной кислоты при 40° в течение 2 час. При охлаждении выкристаллизовывается ФТГ-производное из маточного раствора при охлаждении получают дополнительное количество кристаллов. Большинство ФТГ-производных аминокислот перекристаллизовывают из водной уксусной кислоты или этанола. Температуры плавления ФТГ-производных аминокислот приведены в табл. 20. [c.160]

Фенилизотиоцианат реагирует не только со свободными аминокислотами, но и с N-концевой аминокислотой пептидов, отщепляя ее от пептида. Если, например, анализируют тетрапептид к—1—т—п, то реакция проходит следующим образом [c.24]

Вторым важным реагентом для определения N-концевых остатков служит фенилизотиоцианат реактив Эдмана). Это вещество реагирует со свободными а-аминогруппами в разбавленных щелочных растворах с образованием фенилтиокарбамилпептида (уравнение III.4). Последующая обработка продукта реакции кислотой (предпочтительно, по не обязательно в органических растворителях) приводит к циклизации с образованием фенилтиоги-дантоина N-концевой аминокислоты (его структура может быть установлена хроматографически) и новой N-концевой аминокислоты [c.87]

Химические реакции белков отличаются от реакций аминокислот и тем, что большинство реагентов на белок взаимодействуют более чем с одной функциональной группой. Например, кетен, который применяется для ацетилирования аминогрупп белка, реагирует не только с ними, но и с фенольными, и сульф-гидрильными группами. Для предотвращения этих побочных реакций обработку желательно вести либо в 1 М растворе кислоты, либо при pH 10, что не всегда благоприятно сказывается на биологической активности ряда белков. Недостаточно специфически реагируют с аминогруппами и такие реагенты, как дини-трофторбензол, азотистая кислота и фенилизотиоцианат, причем специфичность каждого из них оказывается различной для различных белков. Поэтому для каждого белка часто приходится подбирать такие условия, в которых специфичность реакции была бы максимальной. При этом для каждого белка необходимо испытать несколько различных реагентов. [c.63]

Одним из самых ценных реагентов при работе с белками является фенилизотиоцианат, впервые примененный П. Эдманом. Это соединение реагирует с хМ-концевой аминогруппой пептидов [уравнение (2-25)]. Образующийся продукт циклизуется, что в кислой среде влечет за собой разрыв пептидной цепи (2-25). В итоге образуется соответствующий Ы-концевой аминокислоте фенилтиогидантоин, который можно идентифицировать. Проделав ту же операцию с укороченной указанным путем пептидной цепью, можно определить следующий аминокислотный остаток. При тщательной постановке эксперимента с помощью реакции Эдмана можно пройти вдоль пептидной цепи несколько десятков остатков. Есть специальные приборы — так называемые секвена-торы, в которых все необходимые операции осуществляются автоматически. [c.174]

Реакция протекает в пиридин-водной среде прй pH 8—9 и температуре 40°. Образующиеся фенилтиокарбамилпроизвод-ные аминокислот подвергаются обработке безводной соляной кисдотой, под действием которой они превращаются в фенил-тиогидантоины. Фенилтиогидантоины различных аминокислот могут быть разделены хроматографически при гидролизе щелочью они распадаются на фенилизотиоцианат и соответствующую аминокислоту, которая идентифицируется хроматографически. [c.57]

Другой метод определения Ы-концевых групп (разработанный в 1950 г. П. Эдманом в Университете Лунда, Швеция) основан на реакции между аминогруппой и фенилизотиоцианатом, приводящей к образованию замещенной мочевины (ср. разд. 29.14). Гидролиз соляной кислотой в мягких условиях селективно удаляет Ы-концевой остаток в виде фенилтиогидантоина, который затем идентифицируют. Большое преимущество этого метода состоит в том, что он не затрагивает остальной части пептида поэтому анализ можно вновь повторить и идентифицировать при этом следующую концевую группу в укороченном пептиде. В идеале этот метод можно использовать многократно до полного определения всей последовательности звеньев, аминокислота за аминокисло той однако на практике это оказывается неосуществимым. [c.1049]

Вместо протеинов или пептидов можно обрабатывать фенилгорчичным маслом (фенилизотиоцианат, ФИТЦ) и свободные аминокислоты [182], Как и динитрофенилирование, эту реакцию рекомендуется проводить в том случае, когда смесь аминокислот из-за наличия примесей нельзя непосредственно анализировать методом ХТС ФТГ-аминокислоты часто легче перевести в хроматографируемую форму, чем свободные аминокислоты. То обстоятельство, что ФТГ-аминокислоты поглощают УФ-свет, облегчает количественный анаЛиз аминокислот [182]. [c.425]

Метод Эдмана, разработанный для М-концевых аминокислот (аминокислот со свободной МНз-группой), основан на реакции полипептидов или белков с фенилизотиоцианатом, образующим фенилтиомочевину по концевой МНз-группе. При последующем гидролизе отщепляется фенилгидантоин, а остальная молекула не затрагивается [c.509]

Другим химическим методом определения К-концевых групп является метод Эдмана — реакция с фенилизотиоцианатом. При этом происходит перегруппировка и расщепление с образованием фенилтиогидантоина К-концевой аминокислоты [50]. Для данного способа была разработана стандартная методика [57] и выяснен механизм реакции [51]. Фенилтиокарбамильный пептид, полз ча-ющийся при этой реакции, быстро расщепляется в кислой среде с образованием 5-тиазолинона N-кoнцeвoй аминокислоты и остатка пептида. 5-Тиазолинон затем быстро гидролизуется до фенилтио- [c.403]

Метод, предложенный Эдманом, основан на катализируемой кислотой реакции преобразования фенилтиокарбаматов пептидов, в результате которой образуются фенилтиогидантоины Ы-концевых аминокислот и укороченные пептиды. Фенилтиокарбаматы пептидов легко образуются при 40° и pH 8—9 в результате реакции пептидов с фенилизотиоцианатом [c.30]

Первичную структуру белка можно изучать с помощью фенилтиогидантоино-вого метода. Он основан на реакции фенилизотиоцианата (ФИТЦ) с а-аминокис-лотами, в которой образуются фенилтиогидантоины аминокислот (ФТГ-амино-кислоты, рис. 1.6). [c.24]

Другой подход к Ы-концевому анализу, развитый Эдманом, включает реакцию с. фенилизотиоцианатом СеНвКСЗ. Продуктом реакции является тиомочевина (II), которая легко гидролизуется до идентифицируемого фенилтиогидантоина (III) в условиях, при которых остальная часть белка не гидролизуется (рис. 12.11). Весь процесс можно повторить на оставшемся белке и получить последовательность аминокислот. Этот процесс можно автоматизировать, причем тиогидантоин идентифицируется газохроматографически (гл. 3), а оставшийся белок после очистки и осаждения вновь возвращается в цикл. [c.269]

Другой метод определения концевых групп, предложенный Эдма-ном (1950), включает избирательное отщепление N -концевых аминокислотных остатков. При реакции белка с фенилизотиоцианатом образуется соответствующее фенилтиокарбамильное производное I, которое расщепляется хлористым водородом до фенилтиогидантоина II и модифицированного белка. Наконец, щелочной гидролиз фенилтиогидантои-на приводит к выделению свободной концевой аминокислоты ПГ. [c.675]

Аналогичным образом протекает и рёакция аминогрупп аминокислот с арилизотиоцианатами. Эта реакция была использована Эдманом для определения концевых а-аминокислот в молекуле белка (см. гл. П1) в качестве арилизотиоцианата использовался фенилизотиоцианат [c.56]

Растворитель А пропускают через колонку со скоростью 15 мл час. Когда с колонки сойдет ФТГ-фенилаланин, продолжают элюирование растворителем Б. ФТГ-аминокислоты выходят в следующем порядке лейцин, валин, пролин, фенилаланин, метионин, аланин, трионин, лизин, оксипролин. На фиг. 64 приведены результаты, полученные после реакции фенилизотиоцианата со смесью, содержащей около 0,1 мкМ каждой аминокислоты. [c.168]

Вначале казалось, что металлы атакуют тиоловую SH-rpynny цистеина в белке. Однако удалось снять эффект отравления добавлением свободной аминокислоты гистидина. Гистидин не может конкурировать с сульфгидрильпой группой за ионы ртути поэтому Штейн предположил, что в состав активного центра входит также гистидин — аминокислота, охотно дающая комплексы с металлами. По-видимому, эта догадка правильна. Более того, гистидин, участвующий в активном центре, находится в N-конце полипептидной цепи. Это было доказано следующими обстоятельствами реагенты, атакующие N-концевые группы белков (фтор-динитробензол, фенилизотиоцианат), необратимо ингибируют активный перенос глицерина если в качестве экспериментального материала использовать так называемую строму красных кровяных клеток, т. е. оболочки эритроцитов, остающиеся после их осмотического разрыва (гемолиза), то в веществе оболочек можно обнаружить N-концевой гистидин путем реакции с теми же реаге тами. Важное наблюдение заключалось в том, что в случае предварительного насыщения стромы гликолем (1,3-пропандиолом), когда ферментативные центры были заблокированы, нри реакции с фенилизотиоцианатом концевой гистидин в реакцию не вступал. После отмывания гликоля можно было снова заставить прореагировать гистидин с фенилизотиоцианатом. Эти опыты показывают весьма убедительно, что фермент, действующий в случае активного транспорта глицерина, содержит в своем центре гистидин и притом концевой. Вместе с тем этот опыт подчеркивает трудность, о которой мы уже говорили. В процессах активного переноса все реакции разыгрываются внутри мембраны. И ферменты интегрированы в структуре мембраны. Поэтому так сложно их изучать. Фактически мы еще не знаем с определенностью ни одной из реакций, ведущих к химической диффузии важнейших метаболитов. [c.181]

Первый вопрос решался с помощью радиоактивно меченных аминокислот. Существенно то, что нам известно концевое звено цепи гемоглобина, содержащее КН2-группу, — это валин. Опыт ставился следующим образом препарат отмытых рибосом (большая часть, свьппе 80%, имеет константу седиментации 70 э) подвергался инкубации на среде с набором аминокислот и меченным С валином. Синтез шел сравнительно короткое время, что доказывает кинетический характер эксперимента. После извлечения синтезированного рибосомами белка у последнего определялась общая радиоактивность и активность N-кoнцeвoй аминокислоты путем реакции концевой аминогруппы с динитро-фторбензолом или фенилизотиоцианатом, отщепления меченой концевой группы и ее хроматографической очистки. Молекула гемоглобина (кролика) состоит из 670 аминокислотных звеньев, из которых 46 являются валинами, в том числе 4 валина — КНа-концевой группы (в молекуле гемоглобина содержится [c.453]

Реакция фенилизотиоцианата с аминогруппами белков очень похожа на соответствующую реакцию изоцианатов. Было найдено, что фенил-изотиоцианат можно применять для определения содержания аминных концевых групп в белках и последовательности аминокислот в полипептидах и белках в последнем случае проводят постадийное расщепление с аминного конца молекулы. Метод основан на специфической реакционной способности фенилизотиоцианата, который в среде пиридина реагирует с концевыми аминогруппами, образуя фенилтиокарбамилпептиды (ФТК-пептиды). Эти производные при нагревании с безводным хлористым водородом в среде нитрометана легко перегруппировываются, образуя фенил-тиогидантоин N-концевого аминокислотного остатка исходного белка. При нагревании со щелочью фенилтиогидантоин расщепляется, образуя свободную аминокислоту, которую можно идентифицировать, например. [c.370]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология