Экспрессия генов и клонов

После конструирования вектора рекомбинантные плазмиды смешивают с клетками для трансформации. Например, клетки кишечной палочки со встроенным вектором выращивают на питательной среде, и в процессе этого роста образуются рекомбинантные ДНК, содержащие гены из разных организмов. Поскольку при этом образуются сходные молекулы (клоны), такой процесс называется клонированием. Далее клонированную ДНК вводят в клетки, где и происходит экспрессия генов, т.е. процессы транскрипции и трансляции с образованием необходимого белка. [c.61]

В качестве примера механизма такого типа дифференцировки клетки можно привести перестройку у бактерии Salmonella. В этом случае определенный фрагмент ДНК размером 1000 нуклеотидных пар инвертируется в ходе реакции, катализируемой ферментом сайт-специфической рекомбинации (рис. 10-28). Итак, ДНК в этом сайте может находиться в двух состояниях Влияние инверсии на экспрессию гена объясняется тем, что внутри фрагмента размером 1000 нуклеотидных пар находится промотор, ответственный за синтез определенного белка (названного флагеллином), который локализован на поверхности бактериальной клетки. Если этот промотор находится в одной ориентации, го образуется белок одного типа, а если промотор оказывается в другой ориентации-синтезируется другой белок. Поскольку такое переключение происходит очень редко, клоны клеток растут с одним или другим типом флагеллина. Этот феномен носит название фазовой вариации. Скорее всего такой механизм дифференцировки помогает популяции бактерий защищаться от иммунного ответа организма хозяина. Если у хозяина образуются антитела к одному типу флагеллина. некоторые бактерии, флагеллин которых оказался измененным вследствие перестройки генов, смогут выжить и размножиться. [c.200]

Во многих случаях для изучения экспрессии генов млекопитающих наиболее приемлема так называемая временная экспрессия, происходящая в части клеток в течение нескольких часов после введения ДНК. Если же требуются большие количества продукта, то приходится выделять клоны, клетки которых сохраняют вектор и в ходе пролиферации. Подобное стабильное наследование вектора достигается двумя путями использованием вирусного репликона, например вируса папилломы крупного рогатого скота (ВРУ) (см. гл. 8 тома П этой серии [34]), или в результате интеграции вектора в ДНК клетки-хозяина. Известно, что любая чужеродная ДНК с низкой частотой способна встраиваться в неспецифические участки хозяйской хромосомы получившиеся клоны можно выявить, если использовать подходящий селективный маркер. В гл. 6 тома И данного издания описаны различные селектируемые векторы, а также способы их введения в культуру клеток. В этой главе мы коснемся методов, позволяющих получить высокоэффективную экспрессию интегрирующихся векторов в стабильно трансфицированных линиях клеток. [c.238]

Идентификация клонов. Если вставка содержит гены, способные к экспрессии в новом хозяине, рекомбинантные клоны могут быть идентифицированы по синтезируемому ими продукту. Однако чаще приходится идентифицировать непосредственно нуклеотидную вставку, для чего используют методы гибридизации. Бактериальные (нлн фаговые) колонии выращиваются на нитроцеллюлозных фильтрах, помещенных на чашку Петри с питательной средой (рис. 253). После этого приготавливаются так называемые реплики — к фильтру с исходными колониями прижимается свежий нитроцеллюлозный фильтр, который затем переносится на чашку Петри с плотной питательной средой, где на нем образуются колонии, идентичные первым. [c.436]

Ряд гибридных клеточных клонов (человек - мышь) исследовали для определения в них экспрессии определенных человеческих генов и присутствия тех или иных хромосом человека. Результаты приведены в таблице. Определите хромосомную локализацию каждого искомого гена. [c.332]

Появившиеся в последнее время методы позволяют составлять подробные карты очень больших геномов. Есть две категории карт 1. Физические карты, основывающиеся на строении молекул ДНК, составляющих каждую хромосому. Сюда относятся рестрикционные карты и систематизированные библиотеки клонов геномной ДНК. 2. Карты генетического сцепления их строят, основываясь на частоте совместной передачи потомству двух или нескольких признаков - генетических маркеров, различных у отца и матери и приписываемых определенному участку хромосомы. В качестве маркеров издавна принято использовать те гены, экспрессия которых обнаруживается по их эффекту (таковы, в частности, гены, вызывающие генетические болезни, например мышечную дистрофию). Разработанные сравнительно недавно новые методы с применением рекомбинантной ДНК дали возможность использовать в качестве генетических маркеров короткие последовательности ДНК, содержащие один из сайтов рестрикции и различающиеся у отдельных индивидуумов, такие последовательности особенно удобны для генетического картирования, потому что под действием рестрикционной нуклеазы возникают фрагменты, различающиеся по своей длине, и этот полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) легко может быть выявлен блот-анализом по Саузерну с помощью подходящего ДНК-зонда (рис. 5-90). [c.342]

Первый этап-это слияние соматических клеток человека и мыши. После нескольких клеточных делений образуются клоны, сохранившие лишь одну или несколько человеческих хромосом. Следующим этапом является установление связи между экспрессией данного гена и присутствием определенной хромосомы (или участка хромосомы) в гибридных клонах. [c.291]

Препараты нуклеиновых кислот необходимы для идентификации и выделения генов в процессе генно-инженерных манипуляций, а также для изучения организации и экспрессии генов на молекулярном уровне в трансформированных растениях, В первом случае высокомолекулярная очищенная ДНК и интактная РНК необходимы для получения соответственно геномных библиотек и библиотек ДНК. Подробно методики клони-)ования генов и их анализа описаны в других пособиях [1, 8], 7осле того как изучаемый ген клонирован и его структура установлена, его можно ввести в растения (в неизменном или модифицированном виде) с помощью векторов типа DMGT или векторов, сконструированных на основе Ti-плазмид (гл. 1,2 и 3). [c.236]

Как уже подробно обсуждалось выше, для большинства генов эукариот характерна интрон-экзонная структура, а интроны, присутствующие в первичных транскриптах таких генов, вырезаются в процессе сплайсинга с образованием зрелых молекул мРНК. Для получения экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот, а также изучения тканеспецифической экспрессии генов возникает необходимость в получении кодирующих последовательностей эукариотических генов без интронов. В этом случае задача решается через создание репрезентативных клоно- [c.155]

Для детектирования уровня экспрессии гена lif, устойчивые к 0418 клоны клеток линии R1 были проанализированы методом РТ-ПЦР, с использованием соответствующих праймеров (5GGG T T AG AATGTG 3 и 5G AG AGAGTG AGTG3). Было показано, что экспрессия гена lif обнаруживается в клонах с видимыми признаками морфологической дифференцировки. Возможно, что высокий уровень эндогенного LIF в трансфицированных клетках тормозит их пролиферативную активность и способствует переходу в дифференцированное состояние (Федченко и др., 2001). [c.298]

Одним из приоритетных направлений ген-но-инженерных исследований является достижение правильной экспрессии генов высших эукариот и их вирусов в бактериальных клетках. Однако в данных случаях экспрессию многих клонированных генов уже нельзя выявить по функциональной комплементации в силу некоторых принципиальных различий в организации прокариотических и эукариотических клеток. Несомненно, такой подход неприменим и при клонировании большинства вирусных генов. Поэтому в данной ситуации для поиска требуемых клонов гибридов можно использовать метод радиоиммуноанализа белков in situ, первые варианты которого были описаны в 1978 г. В основу метода (рис. 1.21) положена способность молекул иммуноглобулинов связываться с полистиролом или поливинилом. Кроме того, предполагается, что исследуемый белок имеет не менее двух антигенных детерминант и может связывать по крайней мере две разные молекулы иммуноглобулинов, присутствующих в препарате поликлональных антител, полученных на целевой белок. [c.35]

В 1980 г описана плазмида pTR262 (Ар> Тс с1+), в которой экспрессия гена tet pBR322 находится под контролем репрессора фага Я. Эта плазмида детерминирует фенотип Тс , но становится Тс> после инактивации фагового гена сГ встройкой в него чужеродных фрагментов ДНК. Поэтому такие гибридные клоны (Ap> Тс> с1 ) легко отбирать на среде с тетрациклином. [c.121]

Первую работу, доказавшую возможность правильной экспрессии генов вирусов высших эукариот в бактериальной клетке, выполнили английские ученые в 1979 г. Они проклонирова-ли фрагменты ДНК вируса гепатита В и твердофазным радиоиммуноанализом выявили клоны Е. ali, в которых синтезировался белок кора вируса. При инъекции кроликам экстракта штамма Е. соН, содержащего такую плазмиду, наблю- [c.159]

Генно-инженерные разработки в области зообиотехнологии (в частности,с соматотропином, или гормоцом роста) оказались важными для животноводства (возрастание привесов животных, лактации) Используя метод микроинъекций рДНК в зародышевые клетки млекопитающих (в пронуклеусы оплодотворенных ооцитов, или в яйцеклетки) удается получать так называемых транс-генных животных Клоны реципиентных клеток, содержащие донорный хромосомный материал, или трансгены, различаются по количеству его в широком диапазоне, и если функциональная активность и регуляция экспрессии клонированных генов изучаются на целом организме, то и говорят о трансгенном организме Схема получения, например, трансгенных мышей введением клонированной ДНК в оплодотворенное одноклеточное яйцо приведена на рис 72 [c.209]

В 1980 г. М. Капекчи применил метод микроинъекции для введения плазмидной ДНК в клетки млекопитающих. При инъекции в ядра мышиных клеток L ТК плазмиды pBR322, содержащей встроенный ген тимидинкиназы вируса герпеса, в 50-100 % выросших клеточных клонов выявлялась ферментативная активность тимидинкиназы. Если данную плазмиду вводили в цитоплазму клеток, доля клонов, в которых выявлялась экспрессия гена tk, бьша значительно меньше. Это прежде всего доказывает, что ген вируса герпеса экспрессируется в ядре клетки и, кроме того, что ядерная мембрана является труднопреодолимым барьером для проникновения чужеродной ДНК в ядро клетки. [c.336]

На фанице двух таких участков клетки не смешиваются, как если бы селективное слипание клеток, обладающих одинаковым молекулярным адресом, позволяло им отделяться от клеток, несущих другой адрес. Так, например, если в результате генетической рекомбинации в крыле появляется клон мфкированных, но все же нормальных клеток, то этот клон располагается лишь по одну сторону четко определенной фаницы, разделяющей два парасегмента, образующих крыло. Подразделения тела (в крыле или любом ином органе), образующиеся таким образом, называют компартментами (рис. 16-71). Хотя фаницы компартментов, как правило, не соответствуют фаницам нормальных органов, они совпадают с фаницами доменов, в пределах которых действуют гомеозисные селекторные гены, и это можно наблюдать по экспрессии гена [c.127]

Рис. 16-71. A. Форма маркированных клонов в крыле дрсеофилы указывает на существование границы компартментов. У такой границы край каждого пятна получается прямым. Даже если маркированный клон генетически изменен, что позволяет ему расти быстрее остального крыла и стать очень большим, он все равно не переходит границы компартментов (крайний рисунок справа). Обратите внимание, что эта граница не совпадает с центральной жижой крыла. Б. Характер экспрессии гена в крыле, выявляемый тем же методом, что и на рис. 16-64, Я

Идентификация экспрессирующих рекомбинантных клонов. ТИе-тод идентификации экспрессирующих клонов зависит от свойств продукта экспрессии. Если этот продукт обладает собственной биологической активностью, то ои может быть идентифицирован по ее проявлению. Например, если экспрессии подвергается ген, кодирующий фермент, то клоны идентифицируют по наличию в них соответствующей ферментативной активности клоны, синтезирующие интерферон,— по противовирусной активности клеточных экстрактоа и т. д. [c.439]

Ген, экспрессирующийся во всех трех клонах, должен быть локализован на хромосоме 1 экспрессия другого гена только в клонах В и С будет означать, что он локализован в хромосоме 2, и т. д. Для создания оптимальной системы тестирования хромосомной локализации генов, выбирают клоны, содержащие только половину от общего количества тестируемых хромосом. При этом выбор клонов осуществляется таким образом, чтобы лишь половина хромосом второго клона совпадала с хромосомами первого и т. д. При таком принципе подбора клонов их минимальное количество (с), необходимое для локализации генов на той или иной из п хромосом, будет определяться из соотношения 2 > п. В рассмотренном примере 2 = 8. [c.291]

Стоило лишь выявить необходимые для пролиферации Т-клеток условия, как появилась возможность получать неограничеппо пролиферирующие антиген-специфические линии Т-клеток в культуре путем пепрерывпого добавления 1Ь-2 и периодической стимуляции клеток антигеном с целью поддерживать экспрессию рецепторов 1Ь-2. Из таких линий можно было затем вьщелять одиночные клетки и получать клопы Т-клеток. Как мы уже видели, такие клоны сыграли решающую роль в исследовании Т-клеток. Например, опи позволили вьщелить Т-клеточные рецепторы и их гены кроме того, они широко использовались для изучения механизмов активации Т-клеток и роли Т-хелперов в стимуляции ответов других лимфоцитов. [c.273]

Альтернативные методы скрининга космидных библиотек, описанные в гл. 3, предполагают селекцию космидных клонов с использованием феномена гомологичной рекомбинации in vivo. Остальные главы книги посвящены вопросам, связанным с экспрессией клонированных генов. Для многих белков млекопитающих удалось осуществить высокопродуктивную внутриклеточную экспрессию в Е. oli. Однако гетерологические белки, локализующиеся в цитоплазме, часто образуют трудно растворимые агрегаты, что значительно осложняет получение нативного продукта. В гл. 4 описаны эффективные способы выделения активных растворимых продуктов из нерастворимых белков цитоплазмы Е. соИ. Вероятность деградации специфическими бактериальными протеиназами многих эукариотических белков, синтезируемых в Е. oli, может быть существенно снижена, если их экспрессировать в виде гибридных белков. Такие составные белки, в которых бактериальный компонент обычно представлен -галактозидазой, можно использовать в качестве иммуногенов для получения антисыворотки и моноклональных антител к клонированному эукариотическому белковому домену. Эти вопросы >ассматриваются в двух главах — одна посвящена получению поликлональной антисыворотки, а другая — методам гибридной технологии. В последующих главах книги описаны современные эукариотические экспрессирующие системы в гл. 7 — дрожжевая, далее в трех главах — системы на основе культивируемых клеток млекопитающих и трансгенные животные. В частности, описана система экспрессии с использованием векторов, которые несут гены, обеспечивающие возможность их индуцибельной амплификации это позволяет снимать токсическое действие антибиотиков, введенных в культуральную среду. Клонированные в таком векторе гены также [c.8]

Возможность экспрессии клонированных эукариотических генов в клетках Е. соИ способствовала углубленному изучению множества белков, представляющих интерес для фундаментальных научных исследований и медицины. В тех случаях, когда нативный негибридный белок экспрессируется недостаточно эффективно, часто экспрессия белков или их фрагментов в виде гибридов с полипептидами Е.соИ, такими, как -галактозидаза, оказывалась более успешной. К тому же гибридные белки можно легко очищать с помощью хроматографических методов, разработанных для -галактозидазы. Эукариотические белки, экспрессируемые в составе гибридных продуктов, были с успехом использованы при изучении иммунологически важных участков поверхностных антигенов [1], функций рекомбинантных полипептидов [2], при получении иммунологических зондов, необходимых для исследования ранее не изученных антигенов [3—6], для экспрессии вариантных форм белковых субъединиц и для выделения и исследования клонов ДНК из экспрессирующихся библиотек генов [8—10]. Технология работы с экспрессирующими векторами достигла столь высокого уровня развития, что стало возможным осуществлять в клетках Е. соН достаточно эффективную экспрессию практически любой кодирующей последовательности с образованием гибридного продукта, который можно выделить с помощью разнообразных биохимических методов и использовать его либо в различных функциональных исследованиях либо в качестве иммуногена. Синтез чужеродного полипептида в виде гибридного белка с -галактозидазой, по всей вероятности, значительно увеличивает стабильность этого полипептида в клетках Е. соИ. По-видимому, стабильность белка, а не сила промотора — наиболее важный фактор для успешной экспрессии рекомбинантных белков в бактериях. [c.138]

Оценить эффективность амплификации генов можно либо с помощью гибридизационных методов, позволяющих детектировать увеличение количества копий специфических последовательностей ДНК или мРНК, либо с помощью количественного анализа экспрессии белка. Наиболее информативно сравнение данных по всем трем контрольным параметрам (количества ДНК, РНК и белка), так как изменения этих параметров не всегда коррелируют друг с другом. Кроме того, полезную информацию может дать локализация амплифицированных последовательностей на метафазиых хромосомах с помощью гибридизации in situ например для оценки стабильности экспрессирующих клонов при культивировании в неселективных условиях. [c.262]

Смотреть страницы где упоминается термин Экспрессия генов и клонов: [c.248] [c.256] [c.39] [c.128] [c.249] [c.45] [c.337] [c.178] [c.73] [c.81] [c.143] [c.125] [c.264] [c.406] [c.35] [c.38] [c.93] [c.309] [c.276] [c.330] [c.331] [c.127] [c.456] [c.139] [c.248] [c.249] [c.178]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология