Элюирование в градиенте буфера

Элюирование проводили в градиенте хлорида натрия на фоне исходного буфера. Общие выводы относительно эффективности разделения в градиенте этого типа, а также рекомендации относительно оптимальных условий разделения (с указанием объема колонки и наклона градиента) той или иной смеси пептидов можно найти в работе 44]. [c.415]

Элюирование проводят в градиенте концентрации хлорида натрия (О—2М) на фоне исходного буфера. В заключение колонку промывают тринатрийфосфатом и дистиллированной водой. Перед началом эксперимента колонку вновь промывают исходным буфером. Полноту промывания и уравновешивания контролируют измерением электропроводности и pH элюатов. Все операции проводят при избыточном давлении 1,1 атм. Образцы наносят в виде суспензии в исходном буфере, анализ элюатов ведут по поглощению при 2 60, 280 и 415 нм. [c.311]

Элюирование ДНК с колонки осуществляют в линейно или ступенчато возрастающем градиенте концентрации фосфатного буфера pH 6,8 от 0,005 М до 0,3 М. Нативная ДНК элюируется с колонки в интервале концентрации 0,2—0,25 М, денатурированная ДНК выходит при концентрации буфера 0,15 М. [c.89]

Градиентное элюирование обычно используется с такими детекторами, как УФ-фотометр, детектор по флюоресценции и транспортный детектор, однако в последнем случае возможны осложнения, если составные части градиента не удаляются во время транспортного процесса и мешают детектированию. Например, при детектировании пламенно-ионизационным детектором в качестве подвижной фазы нельзя использовать органические буферы. При программировании растворителя особенно трудно применять так называемые универсальные детекторы, или детекторы общего свойства. [c.71]

Одноколоночный анализ белковых гидролизатов и физиологических жидкостей проводят по единой схеме на колонке 0,9 X Х133 см при 60 °С. Смолу урановешивают 0,25 н. буферным раствором цитата натрия с pH 2,91. Образец вносят в 2 мл буферного раствора с pH 2,0. Первый буферный раствор (0,25 и. с pH 2,91), подают микронасосом со скоростью 30 мл/ч. После установления рабочего давления включают самописец, определяют скорость подачи и включают насос подачи нингидринового реагента, установленный на 30 мл/ч. Поскольку элюирование ведут в градиенте буфера, используют нингидриновый реагент с большей буферной емкостью. Градиент формируют [c.320]

Менее эффективным методом является элюентная хроматография на ионитах, по емкости на два порядка уступающая вытеснительной технике. Однако ее несомненным преимуществом является возможность получения хроматографически чистых аминокислот. Еще в 1950 г. был разработан предельно простой метод препаративного разделения аминокислот на смоле дауэкс 50-Х8 в ступенчатом градиенте соляной кислоты [91]. Аминокислоты выделяли из элюата простым упариванием досуха. Однако в этом случае плохо разделяются серин и треонин, а также лейцин и изолейцин. Основные аминокислоты элюируют 4 н. раствором НС1, и тем не менее элюирование занимает много времени. Поэтому авторами была разработана новая схема элюирования — аммоний-ацетатным и аммоний-формиатным буферами, при которой достигалось полное разделение всех аминокислот. Первой стадией является элюирование ацетатными буферами на колонке с дауэксом 50-Х8 высотой 15 см. При этом происходит разделение основных аминокислот. Первые два пика содержат смесь аминокислот, которая разделяется при рехроматографии. Второй пик, соответствующий тирозину и фенилаланину, хроматографируют на колонке (высотой 60 см) с дауэксом 50-Х8. Материал, соответствующий первому пику, фильтруют через колонку (высотой 15 см) с ам- [c.356]

Дальнейшая очистка пероксидазы проводилась на ионообменнике ДЭАЭ-сефадексе А-50. Не удерживаемые ионообменником белки снимались исходным буфером, затем для элюирования использовали ступенчатый градиент буфера с добавлением хлористого натрия. При изменении ионной силы буфера элюировались искомые анионные изопероксидазы. Каталитическая активность этих пероксидаз с бензидином для вирозных растений оставалась в 2 раза выше контрольной (табл. 19). На рис. 19 дан спектр пероксидаз, элюируемых с колонки исходным буфером (а), и двух анионных изоэнзимов фермента (б), элюируемых буфером с добавлением 0,2 М Na l. Спектр, приведенный на рисунке, соответствует только изопероксидазам вирозного растения, так как он для изоэнзимов пероксидазы здорового растения был идентичным. [c.84]

Принципиальной основой ионообменной хроматографии является то, что сродство вещества к ионообменнику зависит от электрических свойств его самого и относительного сродства других заряженных веществ, находящихся в растворителе. Следовательно, связанное вещество можно элюировать с помощью изменения pH до значения, изменяющего заряд вещества, или добавлением конкурирующего вещества, одним из примеров которого могут служить соли. Поскольку различные вещества обладают разными электрическими свойствами, условия элюирования будут меняться для каждого вида связанных молекул. В общем, для получения хорошего разделения следует выбрать либо непрерывное элюирование в градиенте ионной силы, либо ступенчатое элюирование, (Градиент только pH не используют по причине трудности создания его без одновременного увеличения ионной силы.) При хроматографии на анионитах постоянно повышают либо pH и ионную силу, либо только ионную силу элюента. Хроматографию же на катионитах проводят как в градиенте pH, так и в градиенте ионной силы элюирующего буфера. На практике выбор условий элюирования проводится методом проб и ошибок с учетом условий стабильности анализируемого вещества. Напри- [c.211]

При элюировании в градиенте концентрации буфера и при изменении концентрации детергента в элюенте на объем капли влияет изменение плотности и поверхностного натяжения элюата. При необходимости в этом случае следует вводить определенную поправку. Некоторые модели коллекторов снабжены микропереключателем, подающим электрический импульс при достижении заданного числа фракций. Этот сигнал используют для смены элюента или изменения температуры в колонке. В случае необходимости такое устройство можно изготовить в лаборатории. Переключатель устанавливают на корпусе коллектора под фотоячейкой для отсчета капель. Он включается при помощи штырька, закрепленного на соответствующей пробирке. [c.312]

Триптические пептиды а-и р-цепей гемоглобина хроматографировали в градиенте пиридин-ацетатных буферов [39]. При этом хроматографическое поведение пептидов в целом напоминало их поведение при разделении на смоле дауэкс-50, хотя в профилях элюирования наблюдались несомненные различия. Поэтому те пептиды, которые элюируются на смоле дауэкс-50 в одной зоне, можно разделить на фосфоцеллюлозе, и наоборот. На основании этой работы можно сделать определенные выводы относительно связи между хроматографическим поведением и структурой пептидов. За редким исключением, более длинные, отрицательно заряженные пептиды элюируются в меньшем объеме по сравнению с короткими, положительно заряженными пептидами. Пептиды, содержащие более шести аминокислотных остатков и несущие слабый отрицательный заряд (—2), элюируются при рН<4,7 короткие пептиды, включающие менее семи остатков и в целом заряженные положительно, элюируются при рн > 4,7. В работах [38, 39] отмечено также удерживание фосфоцеллюлозой гистидинсодержащих пептидов. [c.412]

Рис. 5.13. Влияние температуры на связываемость р алкогольдегидрогеназы 1) и фосфофруктокиназы 2) на N -(6-аминогексил)-5 -АМР—сефарозе [2]. Проводился диализ экстракта фермента (0,5 мл), содержащего 81 Е фосфофруктокиназы, 20 Е или 18,7 мг/мл алкогольдегидрогеназы, против 10 мМ К-фосфатиого буферного раствора (pH 6,8) затем раствор пропускался через колонку с замещенной АМР—сефарозой. Элюирование осуществлялось в линейном градиенте концентрации (0—1 моль/л) КС1 (общий объем элюата 40 мл) в 10 мМ К-фосфатном буфере скорость потока 0,4 мл/мин.

Колонка приведена в равновесие с буферным раствором 0,0025 М ацетат натрия (pH 4,9) + +8 М мочевина. Градиент I 0,025—0,10 М буфер (150 мл, начало отмечено стрелкой /) градиент 2 0,10—0,50 М (100 мл, начало отмечено стрелкой 2). Скорость подвижной фазы 11 мл/ч объем фракций 3,7 мл образец 80 мг свиного лютеинизирующего гормона. Детектирование определение поглощения при 280 нм (сплошная линия). Элюирование в линейном градиенте начинали после удаления из колонки несорбирующихся примесей. [c.435]

Колонка 1,2X20 см. Элюирование в линейном градиенте концентрации калийфосфатного буфера (150 мл 0,001 М — 150 мл 0,5 М pH 6,8). Объем фракций 2,4 мл. Образец 1,8 мг трансформирующей ДНК, денатурированной в щелочной среде. [c.75]

Колонка 2X30 см. Элюирование в линейном градиенте концентрации (0—0,48 М) хлорида калия в 0,005 М трис—НС1 буферном растворе с pH 7,5, содержащем 7 М мочевину. Скорость подачи 60 мл/ч. Объем фракций 10 мл. Температура 55 °С. Образец 3050 OEj раствора, апиримидиновой ДНК в исходном буфере, содержащем 7 М мочевину. Номер фракции соответствует числу нуклеотидных звеньев в олигонуклеотиде. [c.92]

Алкалоиды чемерицы Целит-f буфер (pH 3,0) — этиленгликоль (2 1) Хлороформ—этилекхло-рид Элюирование в ступенчатом градиенте 31 [c.108]

Элюирование проводят также в линейных градиентах вода — 0,35 М пиридинацетатный буфер (в случае амберлита G-50) и вода —0,01 н. соляная кислота (на сефадексе G-10) [29]. Элюирование- тиамина на дауэксе AG 50W-X8 проводят 2 н. водным раствором аммиака [30]. [c.185]

Состав системы растворителей на колонке с сефадексом G-25 можно изменить таким образом, что некоторые компоненты станут нерастворимыми и благодаря этому задержатся на колонке, в то время как растворимые компоненты будут элюироваться. Подобное явление имеет место, например, при дифференцировании по В. Эпштейну и М. Тану [152] так называемых эуглобулинов и псевдоглобулинов сыворотки человека. Если образец сыворотки в 1М поваренной соли поместить на колонку с G-25, уравновешенную предварительно очень разбавленным буфером, и элюировать тем же самым буфером, то вначале белки отделяются от соли. Хорошо растворимые в разбавленном растворе соли псевдоглобулины (главная часть белков сыворотки) элюируются с колонки гораздо раньше, чем Na l. Однако эуглобулины, отделившись от соли, становятся нерастворимыми. При дальнейшем элюировании они вновь растворяются в солевом растворе и так далее. В итоге они выходят с колонки вместе с фронтом поваренной соли. Порат [153] развил этот принцип дальше. Вначале в колонке с сефадексом G-100 создают возрастающий градиент концентрации соли (сверху вниз). Если теперь на колонку нанести смесь белков и элюировать водой, то компоненты смеси будут мигрировать быстрее, чем будет изменяться градиент соли. Таким образом, белки в соответствии с их растворимостью в солевых растворах выпадают в осадок в разных местах колонки, вновь растворяются по мере сдвига градиента и так далее. Таким путем (т. е. зонным осаждением) можно разделить белки одинаковых размеров, но с различной растворимостью. [c.200]

Колонки 20X5 мм) с МАВ-Ь—сефадексом, имеющим различную пористость, уравновешивались 10 мМ фосфатным буфером (pH 7,5) неадсорбируемый белок отмывался тем же буферным раствором элюирование осуществлялось в градиенте концентрации (0—0,5 моль/л) КС1 в том же буферном растворе (общий объем элюата 20 мл) / —Лзао бычьего сыворо-ТОЧНОГО альбумина 2— активность лактатдегидрогеназы 3— активность малатдегидрогеназы. [c.65]

Другим примером влияния концентрации аффинного лиганда является аффинная хроматография смеси лактатдегидрогеназы и сывороточного альбумина на N -(6-аминогексил)-5 -АМР — сефарозе [8]. При высоких концентрациях лиганда (1,5 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) для элюирования с )ермента необходимо введение NADH ( удар ). При низких концентрациях (0,125 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) десорбция фермента достигается просто градиентом концентрации (от О до 1 моль/л) хлорида калия. Дальнейшее уменьшение количества прикрепленного лиганда (0,025 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) приводит к прогрессивному увеличению доли лактатдегидрогеназы, элюируемой исходным уравновешивающим буфером даже перед наложением линейного градиента солей. В то же время [c.75]

Фермент, разбавленный уравновешивающим буфером [10 мМ (КН2РО4+КОН), pH 7,5] до подходящей концентрации а), или 10 Е лактатдегидрогеназы, суспендированной в 100 мл уравновешивающего буфера (б), инкубировались с №-(б-аминогексил)-5 -АМР—сефарозой (0,5 г влажного препарата сорбента, 1,5 мкмоль/мл 5 -АМР) в смесителе Коултера при 4,5 °С. Через 30 мин (а) или определенные интервалы времени (б) инкубация приостанавливалась и после отстаивания сорбента (через 15 мин) удалялся супернатантный раствор. При пятиминутных периодах инкубации сорбент отмывался тремя порциями по 5 мл уравновешивающего буфера, затем вновь суспендировался с 2,5 мл уравновешивающего буфера и переносился в колонку (50X5 мм). Для элюирования через колонку пропускалось 11,0 мл уравновешивающего буфера, содержащего линейный градиент концентрации (0—1,0 моль/л) K l (общий объем элюата 20 мл). Ферменты определялись в промывках и элюатах колонки. [c.85]

М хлорид магния (pH 7,5). Около 90% фермента, пропущенного через колонку, не задерживаются и только 10% остаются связанными в колонке посредством электростатических связей и могут быть элюированы растворами с высокой ионной силой, например 1 М хлористым натрием. На основании этих результатов можно сделать вывод, что в данных условиях аминная часть лиганда мало участвует в связывании фермента. При хроматографии р-галактозидазы в аналогичных условиях (единственное отличие состояло в том, что к 0,05 М трис-НС1-буферу не добавлялись соли) почти весь нанесенный фермент был неспецифически связан в колонке 85% фермента десорбировалось при увеличении ионной силы буферного раствора добавлением 1 М хлористого натрия. Очень хорошие результаты получались, если связывание р-галак-тозидазы на замещенном геле проводилось при высокой ионной силе (1,8 М фосфатный буферный раствор), а последующее элюирование при помощи растворов с понижающимся линейным градиентом ионной силы. [c.96]

A. Проводились исчерпывающий диализ 0,5 мл экстракта фермента, силсржащеги 40,5 Е фосфофруктокиназы и 10 Е или 9,9 мг/мл алкогольдегидрогеназы, против 10 мМ фосфата (pH 6,5). содержащего 0,2 моль/л КС (этот буфер был также использован для уравновешивания), и адсорбция на колонке с АМР — сефарозой. Затем матрица последовательно промывалась а) уравновешивающим буфером (24 мл) б) 5 мМ NADH в том же буфере (5 мл) в) буфером (5 мл) г) 5 мМ. МР-ЬБ м.М.. Mg2-I- в буфере (5 мл). Скорость потока 0,4 мл/мин, . Элюирование в градиенте концентрации K I в условиях, описанных выше (А). После адсорбции колонка промывалась 20 мл 10 мМ фосфатом (pH 6,8), содержащим 0,2 моль/л КС . Линейный градиент концентрации (0,2—0,8 моль/л) КС создавали в том же буфере объем [c.112]

Пример градиентного элюирования специфическим элюентом приведен на рис. 10.6 нативный лизоцим, специфически сорбированный на три-(М-ацетилглюкозамин) —сефарозе, элюируется концентрационным градиентом три-(Ы-ацетилглюкозамина), различной крутизны [7]. Концентрационный градиент специфически элюирующего реагента всегда задавался после промывки исходным буфером. Количество наносимого на колонку фермента, параметры колонки, состав буфера и другие условия были одинаковыми для трех разбираемых случаев. Отличались только скорости изменения концентрации три-(Ы-ацетилглюкозамнна), как это видно из рисунка. Выходы белка составляли приблизительно 90%. Лизопим [c.267]

Режим анализа. Колонку уравновешивают пятью объемами стартового буфера (0,1 М пиридинацетатный буфер pH 3,5) при температуре 50 °С, которая поддерживается в ходе всего анализа. Вначале элюирование ведут помощью линейного градиента концентрации и pH пиридинацетатного буфера — от 0,1 М пиридина и pH 3,5 до 2,0 М пиридина и pH 5,0. Такой градиент получают, помещая по 259 г стартового буфера (0,1 М, pH 3,5) и конечного буфера (2,0 М, pH 5,0) в два сообщающихся у дна сосуда-смесителя с одинаковым внутренним диаметром. Это устройство аналогично простому градиентному устройству, изображенному на рис. 6Ь в работе Блока и Линга [157]. Отводящую линию из первого сосуда смесителя соединяют через кран с насосом. Рекомендуется использовать трехходовой кран, для того чтобы в систему можно было включить третий буфер. [c.80]

Устойчивость комплексов, образуемых борат-ионами с сахарами и полиолами, зависит от различных структурных факторов, которые обусловлены числом соседних ис-гидроксиль-ных групп, а также от экспериментальных условий, в частности от pH и ионной силы среды и концентрации в ней борат-ионов. Первые сообщения о разработке метода разделения смесей сахаров на сильноосновной анионообменной смоле дауэкс 1 в боратной форме в ступенчатом градиенте pH (от 8 до 9) и концентрации боратного буфера появились около 30 лет назад [70, 71]. В дальнейшем этот метод нашел применение для фракционирования полиолов [72]. Однако предложенные первоначальные условия не обеспечивали удовлетворительного разделения, а время анализа составляло примерно 60 ч. Данный метод обычно не находил применения в качестве аналитической методики до тех пор, пока интенсивные исследования влияния различных факторов, в частности температуры, ионной силы буфера и размера частиц смолы, на эффективность и скорость хроматографии не привели к значительному улучшению характеристик разделения. Использование смолы со средним размером частиц 20 мкм и подогрева колонки до температуры 50°С при градиентном элюировании буферами с увеличивающейся концентрацией бората (0,1—>-0,2 М) и хлорида (О—>-0,2 М), [c.21]

НО ОТ 0,01 М калийфосфатного буфера (pH 7) до 0,01 М фосфата (pH 7)+0,01 М КС1. Общий объем, необходимый для создания градиента, равен 250 мл. Прежде всего берут два химических стакана на 250 мл, которые устанавливают так, чтобы их можно было соединить П-образной стеклянной трубкой (рис. 16.5), или используют химические стаканы, один из которых (резервуар) имеет внизу одно выходное отверстие, а другой (смеситель) — два. Смеситель помещают на магнитную мешалку и соединяют выходное отверстие посредством трубки с колонкой. В резервуар добавляют 125 мл фосфатного буфера + КС1, а в смеситель—125 мл того же фосфатного буфера без КС1. Независимо от этой установки через колонку пропускают сверху некоторое количество 0,01 М фосфатного буфера для уравновешивания системы исходным элюентом. Затем начинают элюирование, пропуская через колонку раствор из смесителя. Элюирование продолжают при перемешивании до тех пор, пока все содержимое сосудов не перетечет в колонку. Линейность градиента проверяют, определяя во фракциях количество хлорида. Необходимо предотвратить перемешивание содержимого двух сосудов до начала элюирования, поэтому входное и выходное отверстия в смесителе должны быть снабжены зажимами. [c.196]

Смотреть страницы где упоминается термин Элюирование в градиенте буфера: [c.94] [c.415] [c.240] [c.53] [c.310] [c.435] [c.453] [c.76] [c.81] [c.91] [c.269] [c.278] [c.84] [c.91] [c.315] [c.302] [c.240] [c.307] [c.244] [c.124] [c.171] [c.213] [c.197]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология