Полинуклеотиды как затравка

Для получения продуктов с уникальным 5 -концом синтез ДНК начинают с помощью затравки — олиго- или полинуклеотида, комплементарного матрице на участке, расположенном рядом с 3 -концевой областью матрицы. Затравка содержит свободную З -ОН-группу, необходимую ДНК-полимеразе для начала синтеза ДНК. Гибридизуясь с матрицей в определенном месте и включаясь во вновь синтезируемую ДНК в качестве ее 5 -концевого участка. [c.327]

При использовании частично очищенного фермента образованию полимера предшествует индукционный период. Хотя индукционный период можно уменьшить, добавляя небольшие количества олигонуклеотида или полинуклеотида, полная зависимость реакции от присутствия такой затравки не установлена. Между затравкой и продуктом реакции существуют сложные отношения. Действие олигонуклеотидов при уменьшении индукционного периода, по-видимому, неспецифично. Например, соединение, состоящее из остатков адениловой кислоты, инициирует в одинаковой степени полимеризацию как УДФ, так и АДФ. [c.479]

Хорошо очищенные препараты ДНК-полимеразы из Е. соН при инкубации с дезоксирибо- и рибонуклеозидтрифосфатами в присутствии Мп++ и ДНК-затравки дают смешанные полинуклеотиды, в каждую цепь которых входят как дезоксирибо-, так и рибонуклеотиды. Такой смешанный полимер также отражает [c.354]

Очевидно, что полимеразы могут инициировать синтез новых цепей только при наличии (в дополнение к матричной цепи) затравки, т. е. полинуклеотида (который может быть коротким), функционирующего как акцептор нуклеотидов в ферментативной реакции. Таким образом, можно сказать, что новая цепь образуется на конце затравки и сбоку от матрицы. На рис. 11.3 длинная цепь является матрицей, а короткая — затравкой это может быть либо одноцепочечная матрица с добавленной затравкой, либо двухцепочечная ДНК с пробелом в одной цепи, где З -конец разорванной цепи будет служить-затравкой. [c.15]

Ферментативный синтез полинуклеотидов может идти и без матрицы. В этом случае полимер получается после латентного периода,- продолжительность которого убывает с ростом концентрации фермента. Так идет, например, синтез поли-АТ. Если в качестве затравки введен олигомер, то лаГ Период быстро убывав" с его длиной. Даже короткие олигомеры могут служить матрицами для растущего полимера, который с матрицы соскальзывает. Соответствующая кинетическая теория позволяет получить зависимость времени синтеза полимера от его дли-Hbi и от Скорости отделения цепи от йатрицы, па которой она растет. Эта скорость резко убывает при длине олигомера, превышающей 4 нук-леатида. По-видимому, это критический размер матрицы, при котором новая цепь может образовывать с матрицей двойную спираль. [c.253]

ДНК-полимеразы. ДНК-полимеразы относятся к типу ферментов, образующих фосфодиэфирные связи н использующих в качестве субстрата дезоксинуклеозндтрифосфаты (dNTP). Необходимым условием работы таких ферментов, как правило, является наличие матрицы и затравки. Матрицей служит одноцепочечная ДНК, и ДНК-полимеразы ее копируют, синтезируя комплементарную полидезоксирибонуклеотидную цепь. Синтез не может начаться без затравки, представляющей собой олиго- или полинуклеотид, комплементарный матрице и имеющий свободную 3 -ОН-группу, с которой начинается присоединение первого нуклеотида вновь синтезируемой цепи [c.348]

Фермент обнаружен также в тканях растений и животных. Действие фермента неспецифично. Состав затравки также не оказывает влияния на состав синтезируемого продукта. В качестве за яравки можно взять любую РНК или любой полинуклеотид. Состав образующейся под действием фермента РНК зависит только от количества и соотношения нуклеозиддифосфа-тов в реакционной среде. Если в реакционной среде будут все четыре нуклеозиддифосфата в равных соотношениях, то и в синтезированной РНК получается такое же соотношение между нуклеотидами если в среде будет преобладать какой-либо нуклеозиддифосфат, то он же преобладает и в составе РНК. Можно внести в среду только один нуклеозиддифосфат, например АДФ или УДФ, и в этом случае под действием фермента синтезируются соответственно полимеры адениловой или уридиловой кислот. Однако связи, возникающие между отдельными нуклеотидами в цепи, всегда аналогичны связям между отдельными нуклеотидами в РНК- [c.278]

Экстракты из тканей животных содержат фермент, осуществляющий добавление нуклеотидильных звеньев к концам полинуклеотидных цепей. Обычная ДНК-полимераза требует присутствия всех четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, ионов магния и ДНК-затравки, представляющей собой одноцепочечный полинуклеотид, на котором собирается новая, комплементарная цепь. Поэтому фермент можно назвать репдикациопным ферментом его активность подавляется при отсутствии одного или нескольких трифосфатов. Второй фермент, описанный в 1962 г. [46], катализирует включение концевых нуклеотидных звеньев в молекулу ДНК-затравки за счет отдельных трифосфатов. Он не стимулируется добавлением остальных трех трифосфатов, но цистеин усиливает его активность. Его можно назвать концевым или терминальным ферментом [47, 48] его можно использовать при биосинтезе полидезоксиадениловой кислоты [491. [c.211]

При работе с неочищенными препаратами полинуклеотидфосфорилазы затравка не нужна. Но при работе с хорошо очищенными препарами полинуклеотид начинает образовываться только после определенного лаг-периода этот лаг-период можно устранить, если добавить небольшие количества полинуклеотида или даже некоторых олигонуклеотидов, нанример триадениловой ф — А — ф — А — ф — А или диаденилово ф — А — ф — А кислот. Олигонуклеотидные затравки включаются во вновь образованные полинуклеотиды. Например, диаденнловая кислота, меченная по фосфору, при инкубации с УДФ и очищенным ферментом образует полинуклеотид следующим образом [c.254]

Олигонуклеотид с З -концевой гидроксильной группой может служить затравкой полимеризации, т. е. акцептором, к которому присоединяются полимеризующнеся остатки мононуклеотидов. Последовательность мономеров в растущей полимерной цепи при этом не зависит от последовательности мономеров в добавленном олиго-или полинуклеотиде добавленная затравка входит в состав продукта реакции, составляя его 5 -концевую последовательность. Такая функция олиго- или полинуклеотида наблюдается для реакций, катализируемых терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой и полинуклеотидфосфорилазой. [c.97]

Иногда наблюдается и более сложная функция олиго- или полинуклеотида в ферментативной полимеризации. Так, при добавлении к ДНК-нолимеразе двухцепочечных комплексов олигодезоксинуклеотидов, цепи которых имеют различную длину, происходит достраивание их до полных двухцепочечных комплексов. При этом одна из цепей комплекса служит затравкой полимеризации, а другая — матрицей, определяющей нуклеотидную последовательность синтезирующегося участка полимера. [c.99]

Если в реакцию, катализируемую РНК-полимеразой, вводится только один нуклеозид-5 -трифосфат (из четырех), происходит синтез гомополимера, структура которого не является комплементарной копией добавленного полинуклеотида. При таком синтезе — синтезе повторением (reiteration)—полимеризация начинается на участке полинуклеотидной матрицы, содержащем последовательность по крайней мере трех остатков нуклеотидов, комплементарных добавленному единственному нуклеозидтрифосфату. Продукт, образовавшийся в результате такого частичного копирования последовательности матрицы, служит затравкой для дальнейшей ферментативной полимеризации, приводящей к гомополинуклеотиду. [c.99]

В некоторых случаях возможна ферментативная полимеризация и в отсутствие добавляемого олиго- или полинуклеотида. Обычные препараты полинуклеотидфосфорилазы катализируют полимеризацию нуклеозиддифосфатов и без затравки или инициатора. Такая способность, однако, теряется при дальнейшей очистке фермента она связана, очевидно, с присутствием олигонуклеотидов в мало-очищенных ферментных препаратах. В некоторых условиях удается осуществить синтез полинуклеотидов без матрицы с ДНК- и РНК-полимеразами эти случаи будут рассмотрены ниже. [c.99]

Еще одним доказательством комплементарной природы РНК, полученной на данной ДНК-затравке, служит образование специфического комплекса при нагревании с последующим охлаждением смеси ДНК-затравки и РНК-продукта. При эквимолекулярных соотношениях два полинуклеотида образуют гибридные комплексы, причем ренатурация ДНК исключается благодаря большей стабильности гибрида. Образование гибрида специфично для ДНК-затравки и не происходит с другими дезоксинуклеиновыми кислотами, даже если они обладают сходным нуклеотидным составом. Следовательно, средний нуклеотидный состав, анализ ближайшего соседа и полная комплементарность последовательности — все говорит о доминирующей роли последовательности нуклеотидов в затравочной ДНК в определении природы ферментативно синтезированной РНК- При использовании определенной бактериальной системы Mi ro o us lysodeikti us) не было обнаружено, чтобы матрица и продукт образовывали промежуточные соединения, гибриды (в отличие от ДНК-полимеразы). Далее, после ферментативного синтеза РНК не происходит изменений в плотности матрицы и денатурации (разделении нитей) ДНК- Следовательно, либо двухспиральная ДНК действует как матрица, не раскручиваясь, либо механизм заключается в том, что функционируют небольшие одноцепочечные олигонуклеотидные участки, непосредственно прилега- [c.319]

Неизвестным оставался пока порядок расположения нуклеотидов в триплете, так как вероятность всех трех комбинаций УУЦ, УЦУ и ЦУУ одинакова. Но уже изобретены приемы, позволяющие экспериментально изучить и этот вопрос. Принцип одного из них следующий. Для синтеза поли-У берется инициирующая затравка в виде короткого полинуклеотида типа ГГУУ или ААУУ, содержащего дифосфатную группу в 5-м положении около У. Результирующие полинуклеотиды содержат цепочки поли-У с па- [c.424]

Равновесие в реакции достигается при использовании для синтеза 60—80% нукле-озиддифосфатов. Этот фермент обнаружен в составе многих микроорганизмов и в растительных тканях. Присутствие его в тканях животного происхождения требует дополнительных доказательств. Он широко применяется в лабораторной практике синтеза искусственных полирибонуклеотидов. Для действия неочищенных препаратов полирибонуклеотид—иуклеотидилтрансферазы не требуется затравки, тогда как для проявления активности высокоочищенных препаратов нужно добавить не( ьшое количество полинуклеотида или некоторых олигонуклеотидов. Олигонуклеотид-ные затравки включаются в синтетический продукт и являются неспецифичны- [c.67]

Аналогично в качестве затравки могут выступать тРНК или различные синтетические полинуклеотиды, не входящие далее в состав синтезируемого полимера Точный механизм реакций с подобного рода затравками остается неизвестным. Затравочный полинуклеотид должен удовлетворять одному обязательному условию, а именно не должен быть комплементарным синтезируемому гомополимеру, так как в противном случае он будет выполнять роль ингибитора. Так, полиуридиловая кислота тормозит синтез полиадениловой, полинуклеотид поли-(АрОрирС) — синтез иоли-цитидиловой. Однако это объяснение не является универсальным. [c.442]

Известны также ферменты, осуш ествляюш ие синтез гомоиолииуклео-тидов из нуклеозидтрифосфатов. Для реакции необходимо присутствие затравки, роль которой могут выполнять полинуклеотиды или РНК. Присутствие ДНК для таких ферментных систем не обязательно Значение этих ферментов пока неясно. [c.445]

Методика определения обратной транскриптазы приведена в табл. 9.5. Вирусную полимеразу высвобождают мягким лизисом вирионов детергентом, а затем тестируют на poly (С)-матрице с oligo(dG)-затравкой. Включение метки (меченного Н dGTP) в новосинтезированный полинуклеотид служит мерой ферментативной активности препарата эта величина в свою очередь отражает титр вируса. Культуральную среду с ожидаемым высоким титром вируса (<10 /мл) можно анализировать непосред- [c.297]

ДНК-полимераза обладает еще одним видом ферментативной активности в определенных условиях она способна расщеплять цепи ДНК. ДНК-полимераза постепенно гидролизует цепь ДНК с З -гидроксильно-го конца. При этом отщепляются мононуклеотиды. Таким образом, ДНК-полимера-за I является также 3 ->5 -экзонуклеазой (рис. 24.28). Удаляемый нуклеотид должен иметь свободный З -ОН-конец и не должен находиться в составе двойной спирали. Является ли такая экзонуклеазная активность фермента нежелательным побочным эффектом, или она каким-то образом участвует в биологическом действии ДНК-по-лимеразы Эксперименты с использованием химически синтезированных полинуклеотидов с некомплементарным остатком на конце затравки показали, что 3 —> — > 5 -экзонуклеазная активность выполняет в процессе полимеризации функцию редактирования. Рассмотрим полимер, показанный на рис. 24.28, в котором последовательность остатков dT образует двойную спираль с более длинным полимером dA. На З -конце этой poly(dT)-пo лeдoвaтeль-ности имеется один остаток d , который [c.24]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология