Олигонуклеотиды Очистка

Несмотря на применение защищенных производных нуклеотидов и нуклеозидов, некоторые побочные реакции (например, образование пирофосфатов при синтезе исходя из моноэфиров фосфорной кислоты) все же имеют место вследствие этого требуется тщательная хроматографическая очистка продуктов реакции. Одним из приемов, позволяющих существенно упростить очистку продуктов реакции, является фиксация одного из компонентов реакционной смеси на полимерном носителе Такой полимер может быть легко отделен от других компонентов реакционной смеси. Продукт реакции, фиксированный на полимере, можно подвергать дальнейшим превращениям, что значительно упрощает многостадийные синтезы. Наконец, после выполнения всех стадий продукт может быть отщеплен от полимера и выделен в чистом состоянии. Такой подход к синтезу олигонуклеотидов привлекает сейчас большое внимание . Неспецифичность химических методов создания межнуклеотидной связи, являющаяся недостатком химического подхода к синтезу олигонуклеотидов (получение защищенных производных нуклеозидов и нуклеотидов требует многостадийных синтезов), в данном случае дает ряд преимуществ, поскольку в синтез олигонуклеотидов могут быть введены самые разнообразные производные нуклеозидов, в том числе и синтетические аналоги компонентов нуклеиновых кислот. Это открывает широкие возможности исследования связи структуры и функции природных полинуклеотидов. [c.86]

Отдельные пятна элюируют, и в тех случаях, когда не требуется дополнительной очистки, олигонуклеотиды идентифицируют и определяют молярную концентрацию по их радиоактивности относительно суммарной радиоактивности. Типичные фингерпринты, полученные для РНК вируса-сателлита вируса некроза табака путем гидролиза панкреатической иТ -РНК-азами, показаны на рис. 11.1 и 11.2. Совпадение картин, полученных в разных лабораториях, подтверждает, что для идентификации мономеров, димеров и тримеров достаточно знать их положение на фингерпринте. [c.265]

На каждом этапе колоночной хроматографии содержание белка в смеси увеличивается не более, чем в 20 раз. и поэтому выделить из сложной смеси белков отдельный белок за один цикл практически невозможно. На долю каждого белка, как правило, приходится менее 1/1000 всего белка клетки, и для его очистки требуется последовательное использование нескольких различных типов колонок (рис. 4-47). Гораздо более эффективен метод аффинной хроматографии (хроматография но сродству). В основе этого метода лежат биологически важные взаимодействия, происходящие на поверхности белковых молекул. Так, при ковалентном связывании субстрата фермента с матриксом, например, с полисахаридными шариками, фермент специфически удерживается матриксом и может быть элюирован (смыт) практически в чистом виде. Подобным образом можно иммобилизировать короткие олигонуклеотиды ДНК определенной структуры (см. разд. 4.6.8) и использовать подобные носители для очистки ДНК-связывающих белков, опознающих данную последовательность нуклеотидов на хромосомах (см. разд. 9.1.8). С матриксом можно связать и специфические антитела такой носитель очень удобен для очистки белков, узнаваемых этими антителами. Аффинные колонки обладают высокой степенью специфичности за один цикл хроматографии можно добиться очень высокой степени очистки (1000-10000 раз). [c.213]

Синтетические олигонуклеотиды используются в качестве линкеров или адаптеров для облегчения встраивания ДНК в векторы, затравок для ферментативного синтеза ДНК, а также затравок при секвенировании ДНК и РНК. Их применяют для сайт-направленного мутагенеза и как контрольные элементы для изучения экспрессии генов. Синтетические нуклеотиды используют также для конструирования полных генов. В зависимости от цели использования их длина варьирует от 5 до 60 нуклеотидов. Трудности, возникающие при получении длинных олигонуклеотидов, связаны не с собственно их синтезом, а с очисткой материала. [c.88]

Эту последовательность реакций можно повторять, пока не будет синтезирована желаемая полипептидная цепь. Отметим, что на каждой стадии растущая полипептидная цепь переносится на олигонуклеотидный носитель, а после окончания синтеза оли-гонуклеотидный носитель отщепляют от нерастворимой матрицы. Олигонуклеотид, прикрепленный к полипептидной цепи, облегчит хроматографическую очистку полипептида, а затем его можно отщепить мягкой щелочной обработкой. [c.66]

Из-за относительно малого размера пор болынинстиа продажных модифицированных силикагелей традиционной областью приложения обратнофазовой гидрофобной ЖХВД для интересующих нас объектов было фракционирование и очистка сравнительно низкомолекулярных компонентов белков и НК аминокислот, пептидов, нуклеозидов и коротких олигонуклеотидов. Мы начнем с анализа опыта, накопленного в этой области, чтобы далее обратиться к рассмотрению возможности использования такого типа ЖХВД для исследования самих белков и нуклеиновых кислот. Но сначала сделаем несколько практических замечаний общего характера, относящихся к планированию и подготовке хроматографического эксперимента. [c.192]

Выбор pH буфера для хроматографии полипептидов, олигонуклеотидов пли белков должен послуншть оптимизации условий разделения, как было пояснено выше. Этот выбор можно провести для одного белка, подлежащего очистке, или (в случае фракционирования) для всего исходного препарата. В первом случае для подбора pH нужно располагать хотя бы грубо очищенным белком. Эмпирически подбор оптимального значения pH можно производить по следующей схеме. [c.290]

Очистка и фракционирование длинных олигонуклеотидов (до 17 остатков) методом ионообменной ЖХВД требует принятия мер, предотвращающих образование локальных вторичных структур за счет комплементарных участков. Для этой цели было предложено вести элюцию с колонки Partisil 10-SAX линейным градиентом концентрации фосфатного буфера (О—0,3 М), pH 6, в 30%-ном (а в некоторых случаях 60%-ном) растворе формамида при комнатной температуре [Newton et al., 1983]. [c.322]

Стандартность операций в твердофазном синтезе олигонуклеотидов явилась основой для автоматизации процесса. Принцип работы автомата-синтезатора основан на подаче в реактор с помощью насоса (под контролем микропроцессора) защищенных нуклеотидных компонентов реагентов и р-рителей по заданной программе в колонку, содержащую полимерный носитель с закрепленным на нем первым нуклеозидом. После окончания синтеза и отделения полностью защищенного олигонуклеотида от полимерного носителя проводят деблокирование, очистку и анализ синтезир. фрагментов ДНК. Так, с помощью гидрофосфорильного метода [c.300]

Синтез олигонуклеотидов был осуществлен фосфорамидит-ным методом на автоматическом синтезаторе ASM102U. Очистка олигонуклеотидов проводилась на установке OPS 201. Синтезировано 5 специфических олигонуклеотидов, различающихся по составу и длине 5 -АСА-ТТС-ТАТ-ТТА-ААС-ТАС-ТТС-Т-3 (1), 5 -GAA-GTA-GGA-A -AGA-TGT- TG-3 (2), [c.47]

Хотя первый из описанных выше подходов теоретически пригоден для построения генов любой длины, на практике по мере увеличения числа последовательных лигазных сшивок становится все труднее очищать продукты реакции и получать нх а достаточном для дальнейшей работы количестве. Кроме того, увеличивается расход исходных синтетических олигонуклеотидов. В то же время второй подход пригоден только для получения фрагментов длиной не более 200 — 250 п. о. В связи с этим для облегчения сборки гена (очистки фрагментов и экономии нуклеотидного материала) более целесообразно составлять его из отдельных модулей, предварительно очищенных промежуточным клонироввнием. [c.372]

Анионообменная хроматография оснований на смоле дауэкс 1 является исторически первым примером разделения компонентов нуклеиновых кислот на ионитах. К достоинствам этого метода относится высокое разрешение при элюировании буферным раствором постоянного состава (рис. 37.5). Основания разделяют также на DEAE-целлюлозе [64], однако в основном этот анионит применяют для разделения более крупных фрагментов нуклеиновых кислот (моно- и олигонуклеотидов) или для группового разделения оснований при предварительной очистке. [c.44]

Хроматография гаироко применяется для разделения и очистки полинуклеотидов. Методы, разработанные для определения РНК и ДНК, будут рассмотрены в следующих главах подробное описание этих методов можно найти в соответствующих обзорах [32, 33]. При разработке методов хроматографирования были испытаны колонки из фосфата кальция [34—36], метилированного альбумина [37, 38], полиметакрилата магния (амберлит ШС-50) [39, 53] и като-2 (катионный крахмал) [54] наилучшие результаты были получены при использовании замещенных производных целлюлозы, например эктеола-целлюлозы (целлюлоза, обработанная апихлоргидрином и триэтаноламином) [19, 23, 31, 40—42] или ДЭАЭ-целлюлозы (диэтиламиноэтилцеллюлоза) [43, 44]. При использовании таких колонок наиболее эффективное разделение олигонуклеотидов, содержащих от двух до семи нуклеотидов, достигается путем градиентной элюции мочевиной. С успехом применяются также колонки с сефадексом, обладающим свойством молекулярного сита [45]. Для очистки информационной РНК употребляют колонки из ДНК [46, 47, 48, 49] (стр. 234). [c.34]

В некоторых случаях возможна ферментативная полимеризация и в отсутствие добавляемого олиго- или полинуклеотида. Обычные препараты полинуклеотидфосфорилазы катализируют полимеризацию нуклеозиддифосфатов и без затравки или инициатора. Такая способность, однако, теряется при дальнейшей очистке фермента она связана, очевидно, с присутствием олигонуклеотидов в мало-очищенных ферментных препаратах. В некоторых условиях удается осуществить синтез полинуклеотидов без матрицы с ДНК- и РНК-полимеразами эти случаи будут рассмотрены ниже. [c.99]

В случае полинуклеиновых кислот выделение и очистка представляют значительные трудности [855—857]. Осторожное расщепление приводит к олигонуклеотидам [858, 859] и, в конце концов, к мононуклеотидам и их составным частям [860, 861]. В научном отношении важно то наблюдение, что полирибонуклеотиды могут быть построены с помощью энзимов из рибонуклеозид-5-дифосфата [862], Этот искусственный синтез имеет значение в связи с процессом передачи наследственных признаков, который связывают с нуклеиновыми кислотами [863]. [c.126]

Для получения олигодезоксирибонуклеотидов используют также синтез на полимерной основе , разработанный в химии пептидов. Сущность его состоит в том, что нуклеозид связывают ковалентно с нерастворимым полимером и последовательно наращивают олигонуклеотидную цепь с З -конца. В заключение проводят расщепление ковалентной связи олигонуклеотида с полимером и последующее элюирование олигонуклеотида. Несомненным преимуществом данного метода является легкость очистки и выделения промежуточных и конечных соединений, что позволяет существенно увеличить выходы олигонуклеотидов. [c.395]

Образующиеся после экстракции и осаждения амидиты обычно имеют степень чистоты, достаточную для того, чтобы уровень связывания достигал 95%- Это соответствует синтезу олигонуклеотидов вплоть до двадцатичленных. Для повышения выхода связывания морфолиноамидиты следует подвергать более тщательной очистке с использованием хроматографии на коротких колонках. [c.93]

Аналогично происходит синтез OJIигoнyклeoтидoз в твердой фазе, тoJ]ькo в данном случае их первые члены соединяют с нерастворимой матрицей (специально модифицированный полимер). При этом растущии олигонуклеотид также оказывается в твердой фазе, что значительно облегчает его очистку от побочных продуктов реакции и смену реагентов. По завершении синтеза готовый олигонуклеотид отделяют от матрицы Такой метод позволяет стандартизировать этапы синтеза олигонуклеотидов. На его основе сконструированы так называемые синтезаторы ДНК, осуществляющие полный автоматический синтез олигонуклеотидов длинои в г о-сколько десятков членов со скоростью 4 5 нуклеотида в час. [c.254]

Очистка вещества. Проникающая хроматография используется в основном для очистки высокомолекулярных биологических соединений. С помощью соответствующих гелей или стеклянных гранул проводят разделение и очистку вирусов, белков, ферментов, гормонов, антител, нуклеиновых кислот и полисахарвдов. Методом проникающей хроматографии можно разделять смеси низкомолекулярных соединений, отделять аминокислоты от пептидов, фракционировать пептиды, образующиеся в результате частичного гидролиза белков, а также олигонуклеотиды из гидролизатов нуклеиновых кислот. Используя данный метод, можно выделять низкомолекулярные декстраны из смесей, например из кукурузного масла. [c.99]

Завершая рассмотрение различных олигонуклеотидных праймеров, следует упомянуть о предъявляемых требованиях к их качеству. Праймеры являются довольно критичным компонентом секвенирующих реакций. Как уже отмечалось выше, читабельность радиоавтографа геля или однозначность результатов, получаемых в автоматическом сек-венаторе ДНК, будет зависеть от гомогенности 5 -конца праймера. Поскольку при химическом синтезе олигонуклеотидов, начинающегося с З -конца, эффективность каждой реакции присоединения очередного звена никогда не составляет 100%, то неочищенный продукт будет представлять собой смесь основного продукта и более коротких олигонуклеотидов. Легко подсчитать, что чем длиннее будет синтезируемый олигонуклеотид, тем ниже содержание основного продукта. В связи с этим очищенные праймеры будут давать более лучшие результаты, но очистка праймеров требует дополнительных усилий и значительно увеличивает их стоимость. Что касается коротких модульных праймеров (5-, 6-, [c.75]

Места ковалентных сшивок, а следовательно, и строение полученных олигонуклеотидов определяют методом ближайших соседей. Для этого 5 -концевые фосфатные группы олигонуклеотидных фрагментов метят изотопом 32р (например олигонуклеотиды 2 и 5, см. рис. 1.37). Полученные в результате лигазной реакции олигонуклеотиды (например, 4 и 6) после выделения и очистки подвергают полному гидролизу под действием фосфодиэстеразы и определяют, какой из нуклеотидов содержит 32р. Меченая фосфатная группа окажется у 3 -концевого мономера олигонуклеотида, к которому под действием ДНК-лигазы был присоединен 5 -концевой фосфат второго олигонуклеотида, и таким образом будет определено место сшивки. Если, например, при подобной обработке олигонуклеотидов 4 и 6 метка 32р окажется связанной с тимидином, то это однозначно подтвердит правильность присоединения исходных фрагментов. [c.60]

Для преодоления неправильного комплек-сообразования и избавления от необходимости очистки промежуточных субфрагментов при синтезе искусственных генов методом Кораны предложена последовательная сборка ДНК на твердой матрице (рис. 1.50). Нерастворимый носитель с присоединенным к нему стартовым олигонуклеотидом последовательно обрабатывают небольшим молярным избытком фосфо-рилированных по 5 -концу олигонуклеотидов. Перед добавлением очередного олигомера избыток предьщущего отмывается. По окончании процесса комплексообразования проводят сшивку дуплекса и отщепление его от носителя. Затем дуплекс клонируют в необходимом векторе. [c.69]

В настоящее время для выделения сайт-специфических ДНК-связывающих белков разработаны гораздо более совершенные методы. Процедура обычно начинается с определения сдвига подвижности в геле. Благодаря этому можно выяснить, с каким именно участком на фрагменте ДНК связывается неизвестный белок в клеточном экстракте (см. рис. 9-9). Затем химическим способом синтезируется соответствующий этому связывающему участку двух цепочечный олигонуклеотид, который можно использовать двумя способами. При аффинной хроматографии олигонуклеотид связывают с нерастворимым пористым носителем, например агфозой, а затем таким нагруженным носителем заполняют колонку, которая селективно связывает белки, узнающие определенные последовательности ДНК. Этот относительно нетрудоемкий метод позволяет добиться 10000-кратной очистки. [c.103]

Как уже отмечалось выше, методология олигонуклеотидного синтеза разработана настолько хорошо, что трудно ожидать какого-либо еще существенного прогресса в этой области. Однако, это относится, главным образом, к синтезу обычных олигонуклеотидов, которые после процедур очистки и ферментативного фосфорилирования от натуральной ДНК отличаются разве что размером. Что касается синтеза модифицированных олигонуклеотидов, то здесь имеется огромный простор для химиков-синтетиков по созданию все новых их вариантов. В то же время особенность синтеза модифицированных олигонуклеотидов заключается не в самом химизме реакций присоединения очередных мономеров в ДНК-синтезаторе, а, главным образом, в использовании соединений различной природы (выбор которых диктуется целым рядом причин и условий) при синтезе исходных фосфорамидитов. [c.61]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология