Полипептиды хроматография

Ввиду того, что различия в растворимостях полипептидов очень невелики, для выделения индивидуальных пептидов и.з смесей требуются специальные методы. К ним относятся фракционный диализ, распределительная хроматография (например, на колонке из бумажного порошка или листе бумаги), адсорбционная хроматография, ионнообменная хроматография, электрофорез и противоточное распределение по Крэйгу (т. е. распределение между двумя ограниченно смешивающимися жидкостями). Для характеристики выделенных пептидов и доказательства их однородности применяют противоточное распределение, количественный анализ аминокислотного состава и определение концевых групп полипептидной цепи. [c.383]

Для разделения аминокислот, образовавшихся в результате гидролиза полипептида, еще Э. Фишер предложил использовать фракционную вакуумную перегонку их эфиров. Этот метод требует сравнительно большого количества вещества. В самое последнее время он, однако, вновь становится очень актуальным, так как газовая хроматография позволяет разделить ничтожные количества смеси эфиров аминокислот. Широкое применение для разделения смесей аминокислот нашла за последние годы бумажная хроматография. Если требуется определить качественный состав смеси аминокислот, то проводят двухмерное хроматографирование на листе бумаги и проявляют хроматограмму нингидрином, причем каждая аминокислота дает окрашенное пятно. [c.384]

Развитие методов гельфильтрации, ионообменной хроматографии, ультрацентрифугирования, а также разработка и автоматизация методов анализа первичной структуры макромолекул позволили в сравнительно короткие сроки расшифровать последовательность аминокислотных остатков в токсических полипептидах большинства змей. [c.57]

При работе с новым видом сорбента или с новой партией следует упаковать сначала короткую колонку (10—12 см) при относительно невысоком давлении (20—25 МПа). При хорошем результате можно попытаться упаковать более длинную (200—250 мм) колонку при высоком давлении (40—60 МПа). Если эффективность увеличится примерно вдвое одновременно с увеличением сопротивления потоку в два раза, значит сорбент прочен, его можно использовать при таких параметрах набивки. Если сопротивление потоку возрастет в 2,5—6 раз, это значит, что сорбент непрочен и разрушается, образующаяся пыль резко увеличивает сопротивление колонки, нужно снижать давление при набивке. Особую осторожность следует проявлять при выборе давления для набивки силикагелей с широкими порами (более 10 нм) и с большим объемом пор, которые находят все более широкое применение в эксклюзионной хроматографии полимеров и в анализе биологических объектов — белков, полипептидов и др. [c.118]

Применение современной техники разделения, особенно высокоэффективной жидкостной хроматографии, позволяет относительно хорошо очистить пептиды, содержащие 3—10 аминокислотных остатков. Для построения длинных полипептидов и небольших белковых молекул подходит только классический метод конденсации фрагментов. Синтез фрагментов производят либо в растворе путем ступенчатого удлинения пептидной цепи, либо [c.226]

В основе взаимодействия белков со стенкой лежит в основном механизм катионного обмена. Это возможно, поскольку и в случае отрицательного полного заряда молекулы (особенно при основных pH) всегда имеются в наличии катионные группы, например аргинин-радикалы в цепочках полипептидов. Поэтому путем добавления солей щелочных металлов (например сульфата калия) к буферу, как и в случае ионообменной хроматографии, достигается конкуренция кулоновскому притяжению и вызванное этим притяжением взаимодействие белок - стенка явно уменьшается. Следуя этой концепции, можно для стандартных белков в широкой области р1 (р1 5-11) достичь эффективности 50000-100000 тарелок на метр. И в этом случае недостатком является сравнительно высокая электропроводность буфера (эффективное охлаждение ) которая вынуждает использовать поля низкого напряжения (5 кВ) и длинные капилляры с маленьким внутренним диаметром (25 мкм). Кроме того, большие ионные силы уменьшают как ЭОП, так и -потенциал пробы, что вместе с вышеназванными факторами приводит к длительным временам анализа. [c.67]

Окисленная рибонуклеаза. Действие химотрипсина на рибонуклеазу менее специфично, чем действие на этот субстрат трипсина. Об этом свидетельствуют более низкие выходы полипептидов при разделении гидролизата методом ионообменной хроматографии [154]. В выделенных полипептидах установлено наличие 151 аминокислотного остатка, в то время как в полипептидах, полученных в результате расщепления трипсином, обнаружено всего 124 остатка. По-видимому, это объясняется тем, что некоторые участки полипептидной цепи появляются более чем в одном из пептидных обломков. О более сложном составе гидролизата можно судить по небольшим количествам примесей (как правило, не выше 15%), присутствующих в большинстве основных фракций. Эти примеси не мешали определению аминокислотного состава фракций, но их присутствие еще раз подчеркивает трудности, которые встречаются при фракционировании смесей пептидов, полученных менее специфическими методами гидролиза. Гидролизаты рибонуклеазы были получены инкубированием в течение 24 час с ферментом при pH 7. При более кратковременном инкубировании гидролизат содержал дополнительно [c.204]

Эту реакцию широко применяли для определения меркаптогрупп в белках муки [28—31], и для нее, по-видимому, не требуется точно контролировать pH среды. В работе [32] сообщалось, что соединение I устойчиво в условиях последующего гидролиза полипептида, однако позже выяснилось, что значительная часть этого аддукта (около 20%) претерпевала дальнейший гидролиз с образованием 5-сукцинил-ь-цистеина(П) и этиламина [33]. Для того чтобы избежать необходимости вводить поправки, связанные с частичным превращением соединения I в соединение П [33, 34], было предложено вести гидролиз в условиях, обеспечивающих количественное превращение I во II [28]. Такое полное превращение можно обеспечить путем гидролиза белка, содержащего аддукт ь-цистеина и ЫЭМ(1), в 6 н. соляной кислоте в запаянной и деаэрированной трубке [29, 30] при температуре 120 °С в течение 22 ч или при температуре 110 °С в течение 72 ч [35]. Если в пробе присутствуют лишь чрезвычайно малые количества ь-цистеина, то перед гидролизом в реакционную смесь желательно добавить соединение I в качестве носителя. Для измерения радиоактивности продуктов гидролиза их нетрудно предварительно разделить методом хроматографии на бумаге. [c.354]

Для определения природы С-концевой аминокислоты часто используют ферментативные методы. Обработка полипептида карбоксипептидазой, которая разрывает пептидную связь с того конца пептида, где содержится свободная СООН-группа, приводит к освобождению С-концевой аминокислоты, природа которой может быть идентифицирована методом хроматографии. [c.54]

Нерастворимые в воде полипептиды можно фракционировать в буферных растворах, содержащих 6—8 М мочевины. Мочевину следует перекристаллизовать и обессолить на ионообменнике, поскольку соли, содержащиеся в препарате мочевины в качестве примесей, могут изменить ионную силу раствора, и хроматография станет плохо воспроизводимой. Особенно важно провести предварительную очистку мочевины, если молярность стартового буферного раствора низка (0,001—0,005 М). [c.203]

Выбор оптимальных условий,фракционирования в каждом данном случае делается на основании предварительных опытов хроматографии. Однако, как правило, для фракционирования природных полимеров с катионными свойствами, таких, как полипептиды и белки, удобнее градиентное элюирование с увеличением молярности элюента при постоянном pH. [c.213]

Первым шагом на пути к расшифровке аминокислотной последовательности служит гидролиз всех пептидных связей чистого полипептида. Образующаяся смесь аминокислот анализируется затем при помощи ионообменной хроматографии (разд. 5.18), что позволяет определить, какие аминокислоты и в каком соотношении присутствуют в гидролизате. [c.147]

С-Концы пептидных цепей определяются избирательным отщепле нием концевой аминокислоты с помощью специфического фермента — карбоксипептидазы и последующей идентификацией этой аминокислоты. Если макромолекула белка состоит из двух (или более) пептидных цепей, как в случае инсулина (см. рис. 53), то избирательно разрушают дисульфидные мостики окислением (например, надмуравьиной кислотой) и затем полученные полипептиды разделяют путем фракционирования на ионитах. Для определения последовательности расположения аминокислот в каждой полипептидной цепи ее подвергают частичному кислотному гидролизу и избирательному расщеплению с помощью ферментов, каждый из которых разрывает полипептидную цепь только в определенных местах присоединения какой-то одной определенной аминокислоты или одного типа аминокислот (основных, ароматических). Таким образом получают несколько наборов пептидов, которые разделяют, используя методы хроматографии и электрофореза. [c.376]

Хроматография на бумаге. —Этот метод, введенный Мартином и Синджем2 в 1944 г., используемый теперь во всех областях химии, применим, а частности, для идентификации компонентов смеси аминокислот с дн- и трипептидами, получаемой при частичном гидролизе белков и полипептидов. Компоненты гидролизата распределяются между водой, адсорбированной на целлюлозе и являющейся неподзижной фазой, и органическим растворителем, подвижной фазой (например, водный этиловый спирт, бутиловый спирт, фенол), которая дви кется вдоль листа вверх или вниз, — восходящий или ни- [c.650]

Большое число работ, опубликованных в 1980—1983 гг., посвящено отработке обратнофазовой гидрофобной хроматографии фенил-тиогидантоиновых производных аминокислот (ФТГ-АК). В виде таких производных аминокислоты одна за друго отщепляются при автоматическом определении последовательности аминокислот в полипептиде по методу Эдмана. Эта операция получила название секвенирования белков, а соответствующие автоматические приборы [c.196]

Отметим также, что ион-парная хроматография с элюцией градиентом концентрации (24—48%) пропанола в 0,1 %-ной ТФУ была использована для очистки крупных природных полипептидов (до Af = 10 ООО) на еще менее гидрофобном сорбенте р, Bondapak- N [Roberts et al., 1981). [c.207]

Выбор pH буфера для хроматографии полипептидов, олигонуклеотидов пли белков должен послуншть оптимизации условий разделения, как было пояснено выше. Этот выбор можно провести для одного белка, подлежащего очистке, или (в случае фракционирования) для всего исходного препарата. В первом случае для подбора pH нужно располагать хотя бы грубо очищенным белком. Эмпирически подбор оптимального значения pH можно производить по следующей схеме. [c.290]

Еще одной важной проблемой в стереохимии природных соединений является установление строения полипептидных антибиотиков, продуцируемых бактериями и грибами. Такие полипептиды часто содержат в своей структуре неприродные аминокислоты, т. е. имеющие в-конфигурацию или обладающие структурой, не обнаруженной в белках. Очистка и установление структуры таких сложных соединений, часто вьщеляемых в очень небольших количествах, требует квалифицированного разделения и точных аналитических методов. В этом отнощении исключительно важным является непосредственное определение конфигурации аминокислот методом хиральной хроматографии. Особенно большое значение имеет применение хиральной ГХ для хирального аминокислотного анализа и создания аминокислотных карт гидролизатов. Приведенный ниже пример [24] должен проиллюстрировать сказанное. [c.182]

Последовательность аминокислотных остатков в полипептид-,ной цепи называется ее первичной структурой. Определение пер.-вичной структуры производится путем частичного гидролиза белка с помощью специфических протеаз, катализирующих расщепление пептидной связи лишь между определенными остатками. Так, трипсин атакует лишь те пептидные связи, которые образованы СО-группами остатков основных аминокислот — Apr или Лиз. В результате образуется смесь коротких полипептидных цепей, олигомеров. Такие короткие цепи называются пептидами. Их исследование производится посредством химических и физико-химических методов (хроматография, масс-спектроскопия). Воздействуя другим ферментом, можно разрезать белок по другим связям, получить смесь других пептидов. N- и С-конце-вые остатки белка (см. стр. 68) определяются в результате их химической модификации, предшествующей частичному гидролизу. Зная строение пептидов, полученных при специфическом расщеплении различными ферментами, можно установить первичную структуру белка. Допустим, что белковая цепь имеет структуру [c.73]

Как и в предыдущих разделах, мы попытаемся кратко рассмотреть применение ионообменной хроматографии на примере изучения белков сыворотки. До сих пор наиболее популярным методом разделения сывороточных белков является хроматография на колонке анионообменной ДЭАЭ-целлюлозы по методу Собера и Петерсона [18]. Предложено несколько модификаций этого метода. Фракции сыворотки элюируются с колонки различными способами градиентного элюирования и выходят обычно в следующем порядке IgG (как правило, имеет несколько пиков), р-, а-глобулины и затем альбумин. Этот метод особенно эффективен для приготовления препаратов IgQ высокой иммунохимической чистоты из нативной сыворотки. Его можно комбинировать с другими способами очистки, например с осаждением риванолом, Na2S04 и т. п. Подобным образом в качестве одного из этапов препаративного выделения анионообменная хроматография может применяться для очистки других белков сыворотки. При изучении структуры белка ее можно использовать для выделения и очистки полипептидов после расщепления белка ферментами или какими-либо другими веществами. [c.23]

Показано, что обработка цитохромоксидазы дициклогексил-карбодиимидом (D ) приводит к потере протон-транслоцирую-щей активности, а то аремя как транспорт электронов практически не затрагивается. D в данном случае модифицирует главным образом остатки Glu-90 субъединицы III. Этот район полипептида расположен внутри мембраны и структурно подобен D -связывающему участку протеолипида Н -АТФазы. Потеря протон-транслоцирующей активности происходит под действием антител к 111 субъединице. Препараты цитохромоксидазы. из которых избирательно удалена субъединица 111 (например, с помощью хроматографии комплекса на ДЭАЭ-агарозе), не способны к переносу протонов после реконструкции в липосомы транспорт электронов при этом не нарушается. [c.617]

Для определения [186] аминокислот в полипептидах нри иомопщ хроматографии на бумаге необходимы количества вещества порядка 1 мкмол (иногда 0,1—0,2 мкмол). Применение для этой цели тонкослойной хроматографии [c.97]

Частичная очистка белков и полипептидов может быть достигнута осаждением концентрированными растворами солей, органическими растворителями или путем образования определенных соединений [31, 175]. Для очистки применяются также физические методы ультрацентрифугирование [175], электрофорез [179] и противоточное распределение [36, 187]. При любом методе очистки необходимо иметь критерий гомогенности белка или пептида. Даже кристаллическое состояние не может служить однозначным критерием чистоты [166]. В литературе имеются данные, которые дают возможность предположить, что многие высокоочищенные белки микрогетерогенны [32]. Тесты на гомогенность обычно включают иммунологические испытания, ультрацентрифугирование, электрофорез, диффузию, хроматографию и определение ферментативной или биологической активности [32]. [c.387]

Твердо-жидкостную хроматографию широко применяют для разделения антибиотиков, относящихся к разным классам веществ. Гель-хроматографию применяют при исследовании пени-циллинов, тетрациклинов и полипептидных антибиотиков. Ионообменную хроматографию используют как метод выделения и раздёления углеводсодержащих антибиотиков и полипептидов. Кроме того, ионообменную хроматографию используют при структурных исследованиях для определения аминокислот, входящих в состав полипептидных антибиотиков. [c.203]

Гидролитич. расщепление было с успехом применено для И. целлюлозы, крахмала, полипептидов и др. гете-роценных полимеров. Продукты гидролиза анализируют при помощи хроматографии и масс-спектрометрии, а также др. физич. методами. [c.399]

Умеренно полярные акриловые полимеры применяют для адсорбции из водных-растворов таких веществ, как полипептиды, ферменты, антибиотики, гемоглобины, и для газовой хроматографии веществ различных классов. Полимер XAD-7 применяют для жидкостной хроматографии фенолов в водных и водно-метаноль-ных растворах (Fritz J. S., W i 1 1 i s R. В., J. hromatog., 1973, v. 79, p. 107— 119). Полярные полимеры с амино-, амидо- и сульфогруппами применяют для адсорбции из органических растворителей сильнополярных веществ кислот, спиртов, аминов, тиолов, тиокарбамидов. [c.42]

Лапдман, Дрейк и Диллах [1209] разработали метод бумажной хроматографии для определения концевых аминогрупп в полипептидах.Одновременное определение концевых амино- и карбоксильных групп в полипептидах предложено Шлеглем с сотрудниками [1204, 1205]. [c.162]

КО те пептидные связи, в которых карбонильная группа принадлежит остатку метионина (табл. 6-6). Следовательно, если полипептид содержит восемь остатков метионина, то при обработке бромциа-ном обычно образуются девять пептидных фрагментов. Полученные таким способом фрагменты можно разделить методом электрофореза или хроматографии. Каждый из этих коротких пептидов подвергают расщеплению по Эдману, как было описано для стадии 4, и таким путем устанавливают их аминокислотную последовательность. [c.151]