Вектор при картировании

Принцип этого метода прост. Рассмотрим его на конкретном примере картирования некоего фрагмента ДНК человека величиной 14,9 т.п.н., клонированного на фаговом векторе. Функция этого фрагмента ДНК не ясна. Известно, что он присутствует в количестве не более одной-двух копий на гаплоидный геном. Метафазные хромосомы человека, распределенные на стандартном предметном стекле, обрабатывали с целью удаления примесей связанной РНК и денатурации хромосомной ДНК. В качестве зонда использовали клонированный фрагмент ДНК, радиоактивно меченный ( Н) с помощью ник-трансляции. Пред- [c.314]

Часто бывает необходимо получить мутацию в фаговом геноме какого-нибудь вектора или клона, не прибегая к скрещиваниям, которые могли бы внести нежелательную чужую информацию (например, сайты рестрикции). С другой стороны, часто бывает нужно получить мутации в клонированной чужеродной ДНК. Для этого используется та же самая методика нужно лишь, чтобы функционирование встроенной ДНК приводило к такому фенотипу, который можно выявить. Мутации фага X используются как внешние маркеры при скрещиваниях, проводимых при картировании мутаций в клонированном фрагменте, или как такие маркеры, которые дают уверенность, что рекомбинация произошла внутри клонированного фрагмента. [c.36]

ДНК, клонированную в фаге Я, можно перенести в плазмидный вектор. Так как размер плазмидного вектора меньше размера вектора Я, то многие методики рестрикционного картирования и определения нуклеотидных последовательностей в этом случае значительно упрощаются. [c.52]

Недавно был получен вектор, с помощью которого можно конструировать искусственные дрожжевые хромосомы (YA ) [9]. Это открытие сулит переворот в картировании появляется возможность клонировать фрагменты ДНК, на порядок превышающие по размерам космидные вставки. Вероятно также, что соответствующие геномные библиотеки окажутся более представительными. Метод отпечатков пальцев (фингерпринт) пока пригоден лишь для маленьких YA , но, используя гибридизацию, можно будет присоединять к космидам и большие фрагменты. Скорее всего в будущем для картирования генома будет применяться техника подбора пар, специально разработанная для YA . [c.33]

В рекомбинантных ДНК, поддерживаемых в таких системах, часто возникают внутренние делеции некоторых, например, повторяющихся последовательностей. Кроме того, при введении рекомбинантных ДНК в клетки дрожжей иногда имеет место проникновение в одну клетку нескольких молекул вектора со вставками. В итоге отдельные клоны дрожжевых клеток могут содержать несколько несцепленных друг с другом молекул рекомбинантных ДНК, а рекомбинация между ними вообще может приводить к образованию химерных молекул, которые являются одной из главных проблем, возникающих при использовании YA 40-60% клонов могут содержать химерные молекулы. Все это очень затрудняет физическое картирование генов в хромосомах исследуемых объектов. [c.92]

TOB из геля. Поскольку метод химической деградации требовал довольно больших количеств ДНК, а элюция из полиакриламидного или агарозного гелей не очень эффективна, то разработка многочисленных векторов, несущих сайты для клонирования по многим рестрикционным эндонуклеазам, позволила, основываясь все на том же рестриктаз-ном картировании, расщеплять вставку подходящими ферментами и получать необходимые субклоны в подобном векторе и затем их секвенировать в составе этого же вектора, получая меченные по одному концу фрагменты ДНК, как описано выше. [c.237]

Для генетического анализа какого-либо вида организмов необходимо выявление мутантов с определенными физиологическими дефектами (отличиями от особей, принятых за дикий тип). До недавнего времени такие мутанты получали только в результате статистического (случайного, ненаправленного, общего) мутагенеза популяции организмов с последующей селекцией или отбором мутантов, обладающих характерным фенотипом. Измененный ген в выделенных мутантах может быть затем локализован на геноме путем комплементационного или рекомбинационного анализа с другими мутантами или методами физического картирования. Появление методов генетической инженерии позволило с помощью клонирования в молекулярных векторах извлекать отдельные гены даже из очень больших и сложно организованных геномов. Для клонированных генов может быть расшифрована последовательность нуклеотидов, а на ее основе — аминокислотная последовательность кодируемого белка. Более того, можно клонировать, а затем сравнивать последовательности гена (белка) дикого типа и мутантных форм. Исходя из полученной информации можно определить, какие изменения структуры гена (белка) приводят к тому или иному изменению фенотипа организма. [c.171]

Векторные системы, способные интегрировать крупные вставки (>100 т. п. н.), имеют большую ценность при анализе сложных эукариотических геномов. Без таких векторов не обойтись, например, при картировании генома человека или при идентификации отдельных генов. В отличие от библиотек с небольшими вставками, в геномной библиотеке с крупными вставками скорее всего будет представлен весь генетический материал организма. Кроме того, в этом случае уменьшается число клонов, которые нужно поддерживать, и увеличивается вероятность того, что каждый из генов будет присутствовать в своем клоне. Для клонирования фрагментов ДНК размером от 100 до 300 т. п. н. был сконструирован низкокопийный плазмидный вектор на основе бактериофага Р1 — химерная конструкция, называемая искусственной хромосомой на основе фага Р1. Был создан также очень стабильный вектор, способный интегрировать вставки длиной от 150 до 300 т. п. н., на основе Р-плазмиды (F-фактора, или фактора фертильности) Е. соИ, которая представлена в клетке одной или двумя копиями, с селекционной системой la Z векторов pU . Эта конструк- [c.76]

Искусственные дрожжевые хромосомы (YA ) предназначены для клонирования больших фрагментов ДНК (100 т. п. н.), которые затем поддерживаются в дрожжевой клетке как отдельные хромосомы. УАС-система чрезвычайно стабильна. С ее помощью проводили физическое картирование геномной ДНК человека и анализ больших транскриптонов, создавали геномные библиотеки, содержащие ДНК индивидуальных хромосом человека. YA -вектор напоминает хромосому, поскольку он содержит последовательность, функционирующую как сайт инициации репликации ДНК (автономно реплицирующуюся последовательность), сегмент центромерной области дрожжевой хромосомы и последовательности, образующиеся на обоих концах при линеаризации ДНК и действующие как теломеры, обеспечивающие стабильность хромосомы (рис. 7.3). При встраивании чужеродной ДНК в YA может происходить нарушение рамки считывания маркерного дрожжевого гена. В результате продукт этого гена не образуется, и при выращивании клеток на специальной среде можно наблюдать цветную реакцию. Кроме того, некоторые YA -векгоры несут селективный маркер, независимый от сайта клонирования. Несмотря на все преимущества, YA пока не использовались для промышленного синтеза гетерологичных белков. [c.137]

Для рекомбинационного картирования требуется клетка реципиента с кольцевой ДНК хромосомы и ДНК донорной клетки. ДНК клетки-донора может вводиться в клетку реципиента различными способами с помощью Hfr-хромосомы (при коньюгации), вместе с фагом-вектором (трансдукция), или путем прямой передачи ДНК из клетки донора в клетку-реципиент, как это описано в гл. 4 в отношении пневмококков (трансформация). Образующаяся при этом частично диплоидная клетка называется мерозиготой. Мерозиготы нестабильны, поскольку донорная ДНК представляет собой фрагмент целого репликона. Генетические [c.246]

Недавно сконструированы векторы, содержащие промоторы SP6, Т7 или ТЗ, непосредственно примыкающие к сайтам для клонирования ([8] и неопубликованные результаты). Это позволяет быстро и легко приготовить меченные згр РНК-зонды, специфичные в отношении концов клонированной ДНК и поэтому очень подходящие для использования в качестве зонде в для идентификации новых космид, вставки в которых перекрываются со вставкой в исходной космиде. Этот процесс выделения перекрывающихся клонов известен как прогулка по геному, причем использование промоторных систем SP6/T7/T3 может существенно уменьшить время и труд, затраченный на проведение такой прогулки , поскольку при этом отпадает необходимость в идентификации концов клонированных фрагментов с помощью рестрикционного картирования и физического выделения этих фрагментов для приготовления новых зондов. [c.65]

Космидные векторы — плазмиды, несущие os-последователь-ности, распознаваемые компонентами системы упаковки фага X [1], представляют собой удобный инструмент для клонирования и анализа больших фрагментов геномов, картирования хромосом и клонирования генов, размер которых превышает 20 т. п. н. Хотя в настоящее время разработаны приемы, позволяющие конструировать космидные клоны и оперировать с космидными библиотеками, все же неизбел но возникают трудности при получении и анализе больших библиотек, необходимых для клонирования генома млекопитающих в частности, вызывает затруднение введение специфических модификаций во вставки в тех случаях, когда их нельзя прямо увязать с характеристиками рестрикционной карты. Эти трудности могут быть весьма существенными. Во многих случаях для их преодоления используются методы генетики бактерий, позволяющие упростить илп облегчить решение этих задач. [c.74]

Наилучший способ определения структуры вирусной геномной РНК — анализ провирусной ДНК-формы генома, присутствующей в инфицированных клетках, например, с помощью блот-гибридизации клеточной ДНК [39]. На рис. 9.5 показан вариант такого анализа, демонстрирующий удаление интронов из гека, клонированного в ретровирусном векторе. Как правило, клеточную ДНК расщепляют рестриктирующими ферментами, которые узнают специфические сайты в пределах каждого из вирусных LTR, но не затрагивают внутренние последовательности так, в случае векторов семейства Mo-MLV для этой цели часто используют рестриктазы Xbal и 5ас1. Следует подчеркнуть, что в тех случаях, когда инфицированные клетки имеют мышиное происхождение, гибридизационная проба для блот-анализа не должна содержать MLV-последовательностей. В противном случае родственные MLV эндогенные провирусы ослож- нят интерпретацию картины гибридизации. При необходимости проводят детальное структурное картирование или секвенирование ДНК рекомбинантного провируса, используя клонированную провирусную ДНК. [c.299]

Я2001 [8]—единственный Я-вектор, использованный при картировании aenorhabdiiis. И хотя в этом случае вставка составляет только половину последовательности космидной вставки, клоны оказываются более стабильными. Наконец, для некоторых областей генома отмечено более полное представительство именно в Я-библиотеке (А. Spen e, частное сообщение). [c.33]

Использование YA для получения клонотек нуклеотидных последовательностей. При создании искусственных хромосом дрожжей in vitro в среднем удается клонировать фрагменты ДНК длиной 300 т.п.о. Однако с помощью гомологичной рекомбинации, проводимой непосредственно в клетках дрожжей, можно получать вышеупомянутые вставки в несколько млн п.о. Для реализации полной емкости вектора используют предварительно полученные YA -конструкции, в которых клонированы частично перекрывающиеся последовательности. Для обнаружения перекрывающихся клонов используют рестрикционное картирование с гибридизацией по Саузерну, метод прогулки по хромосоме и ряд других стандартных методов исследования генома, которые будут рассмотрены во втором томе этой книги. После обнаружения таких перекрывающихся клонов проводят скрещивание гаплоидных клеток, содержащих требуемые YA , в полученных диплоидных штаммах индуцируют мейоз, при котором с высокой частотой возникают требуемые рекомбинантные YA с протяженными непрерывными последовательностями - контигами - исследуемого генома. Для предотвращения образования в результате рекомбинации дицент-рических и ацентрических YA , которые нестабильны, объединяемые вставки должны быть клонированы в одной и той же 5 3 -ориентации по отношению к маркерам вектора. После завершения клетками мейотических делений и споруляции в спорах обнаруживают требуемые рекомбинанты, конечная длина которых после проведения серии последовательных скрещиваний может превышать 2 млн п.о. [105, в]. [c.91]

Современные ВАС-векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК длиной до 300 т.п.о. и выше. Рекомбинантные молекулы вводятся в клетки Е. соИ с помощью электропорации (см. раздел 3.8), причем эффективность образования трансформантов в 10-100 раз выше, чем при обычной трансформации сферопластов дрожжей векторами семейства YA . Это позволяет уменьшить исходное количество ДНК, необходимое для конструирования репрезентативных клонотек генов (см. гл. 4). При скрининге таких клонотек используются традиционные методы работы с бактериальными колониями. В отличие от Y АС-ДНК, которая находится в клетках дрожжей в линейной форме, ВАС-векторы со вставками, как и традиционные F -факторы, существуют в бактериальных клетках в виде кольцевых суперскрученных молекул. Это облегчает их выделение и последующую работу с рекомбинантными молекулами ДНК в растворе, а кроме того, допускает повторное введение в бактериальные клетки этих ДНК, выделенных мини-препаративными методами. Поскольку рекомбинантные ВАС-векторы существуют в бактериальных клетках в виде одной копии, исключаются совместное клонирование в одной клетке разных фрагментов ДНК и образование химерных молекул, что очень важно для физического картирования больших геномов методами снизу вверх . Весьма существенным свойством системы клонирования, основанной на векторах семейства ВАС, является ее генетическая стабильность. Исходная структура клонированных фрагментов ДНК в пределах точности использованных методов сохраняется в таких векторах даже после 100 серийных пересевов бактериальных клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК. Все вышеперечисленные свойства переводят векторы ВАС в разряд сверхъемких векторов нового поколения. [c.94]

Современная геномика была бы невозможной без развития систем клонирования крупных фрагментов генома в специальных векторах, способных реплицироваться в клетках вместе со встроенными в них фрагментами. К таким векторам относятся, в частности, искусственные дрожжевые хромосомы (YA ), появление которых стало возможным благодаря развитию молекулярной генетики дрожжей. В результате их появления геном удалось разбить на фрагменты длиной примерно 10 пар оснований, которые в составе YA находятся в библиотеках генов. Каждый фрагмент в этой библиотеке картирован, т.е. приписан к определенному участку хромосом. Это создает предпосылки для быстрого выделения нужного фрагмента генома для работы in vitro как для структурного, так и для функционального анализа. Наличие библиотек фрагментов лежит в основе определения первичной структуры всего генома. [c.7]

Клонирование дрожжевых EN-областей. С помощью детального генетического картирования хромосом S. erevisiae выявлены некоторые гены, расположенные очень близко к центромерам. Например. ген МЕТЫ, необходимый для биосинтеза метионина, тесно сцеплен с центромерой хромосомы 11 ( fiVll). Такое сцепление позволило провести клонирование самой центромерной последовательности. С помощью дрожжевого синтетического плазмидного вектора была создана библиотека геномных последовательностей дрожжей, а затем выделена колония, содержащая плазмидный вектор с геном MfT 14 (рис. 9.49). По данным генетического анализа, эта плазмида, по-видимому, содержит также и функциональную центромеру, поскольку она стабильно сохраняется в дрожжевых клетках, число ее копий ограничивается одной плазмидой на клетку и она сегрегирует при митозе и мейозе как истинная мини-хромосома . Путем [c.210]

Наиболее оптимальным является получение в составе исходного вектора субклонов, различающихся размером делетированных участков вставки между сайтом какой-либо подходящей полилинкерной рестрикционной эндонуклеазы, предшествующим сайту клонирования (со стороны отжига секвенирующего праймера) и прогрессивно удаляющимися местами вставки. Однако большинство вариантов направленного подхода, предполагающего получение серии таких субклонов, укороченных с одного конца вставки, различаясь значительно при проведении делеционных процедур, требуют первого этапа рестриктазного картирования с целью или построения подробной рестриктазной карты секвенируемого фрагмента ДНК, или обнаружения подходящих рестрикционных эндонуклеаз, отсутствующих во вставке, которые могут быть затем использованы для получения необходимых субклонов. [c.249]

Почти все рассмотренные выше стратегии секвенирования протяженных фрагментов ДНК в составе фаговых, плазмидных или фагмидных векторов направленного подхода требуют в той или иной степени предварительного этапа рестриктазного картирования вставки с целью выявления отсутствия в ней сайтов узнавания полилинкерных гексану- [c.273]

Рассматриваемые в гл. 8 стратегии секвенирования протяженных фрагментов ДНК ориентированы, в основном, на определение последовательности нуклеотидов в клонированных вставках длиною от 2 тпн до 45 тпн, что соответствует клонам в обычных плазмидных или космидных векторах. Однако простое переложение этих стратегий для секвенирования полных геномов невозможно, поскольку здесь должен действовать комплексный подход. Более того, учитывая большой объем предстоящей работы при секвенировании целых геномов организмов, должен соблюдаться некий баланс между производительностью выбранного метода, включая избыточность, получаемой с его помощью информации и стоимостью всего проекта. Это вместе с большими размерами геномов как бактерий, так и тем более высших организмов диктует свои особенности. Для последних считается, что усилия, прилагаемые на этапе картирования генома, должны соотноситься с тем количеством нуклеотидов, которые необходимо определить [Roa h et al., 1995]. [c.373]

Только подробное исследование структурно-функциональной организации генома ортопоксвирусов, а также других членов семейства Poxviridae позволит выявить гены, контролирующие свойства патогенности и детерминирующие круг хозяев вирусов, установить эволюционные взаимосвязи поксвирусов и границы изменчивости их конкретных генов. Поэтому большие усилия исследователей направлены на картирование генов данных вирусов и определение их функций. Приоритет в секвенировании и анализе структурно-функциональной организации полных геномов вирусов натуральной оспы, оспы обезьян и оспы коров принадлежит группе исследователей Государственного наз ного центра вирусологии и биотехнологии Вектор , руководимой С. Н. Щелкуновым. [c.390]

Смотреть страницы где упоминается термин Вектор при картировании: [c.456] [c.43] [c.32] [c.32] [c.33] [c.211] [c.271] [c.291] [c.292] [c.92] [c.241] [c.216] [c.44] [c.213] [c.220] [c.261] [c.268] [c.271] [c.272] [c.274] [c.375] [c.169]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология