ДНК геномная, выделение

Выделение геномных клонов, охватывающих картированный сайт [c.470]

Генетическое картирование ставит своей конечной целью определение нуклеотидной последовательности гена и прилегающих к нему участков вплоть до соседних генов. Для этого нужно прежде всего выделить ДНК, соответствующую данному гену. Сначала это сделали на вирусах, у которых легко выделить всю геномную ДНК. С тех пор, однако, выделение любого типа клеточной ДНК стало почти общедоступной процедурой в том случае, если есть соответствующий белковый продукт (хотя при малом количестве белка выделение специфической ДНК может занять довольно много времени). [c.43]

Первый этап получения клонов геномной ДНК обычно включает выделение ДНК и ее расщепление рестриктазой. При этом возникает громадное количество различных фрагментов ДНК, например, в случае [c.231]

Трансгенных животных в помете идентифицируют с помощью гибридизационного анализа высокомолекулярной геномной ДНК, выделенной из тканей хвоста (разд. 10.4.2). [c.313]

Таблица 10.11. Выделение геномной ДНК мыши из тканей хвоста

Рис. 10.12. Слот-блот-анализ геномной ДНК, выделенной из тканей хвоста

Чтобы иметь возможность провести молекулярно-генетический анализ ДНК, нужно прежде всего получить ее в чистом виде. Типичная диплоидная клетка человека в норме содержит около 6 пг геномной и разное количество митохондриальной ДНК. Тотальная ДНК, экстрагируемая из биологических образцов, представляет собой смесь ядерной и митохондриальной ДНК. Выделение ядерной ДНК возможно только через выделение и очистку клеточных ядер. Однако, как показывает практика, присутствие митохондриальной ДНК не мешает проведению ПЦР с использованием праймеров, специфичных для локусов ядерной ДНК, и наоборот. [c.71]

Известны различные методы выделения ДНК из большинства органов некоторых видов растений. В отдельных экспериментах по трансформации может понадобиться анализ геномной ДНК (как ядерной, так и ДНК органелл) для выявления перенесенных последовательностей. В данной главе описаны методы выделения как небольших количеств нуклеиновых кислот, так и процедуры их крупномасштабного выделения. Эти методики нашли широкое применение для получения тотальной клеточной ДНК, а также ДНК из ядер и органелл. [c.238]

При использовании большинства методов выделения ДНК из тканей животных происходит одновременное выделение геномной и митохондриальной ДНК. Последняя, как правило, присутствует в клетках в виде множественных копий, что приводит к высокой представленности митохондриальных генов в полученных препаратах ДНК и в клонотеках, создаваемых на основе этих препаратов. В случае необходимости, для освобождения от митохондриальной ДНК на первых стадиях очистки геномной ДНК получают ядра клеток анализируемых тканей. Альтернативно, при необходимости выделения чистой митохондриальной ДНК вначале получают эти органеллы [65]. [c.41]

Зонды получают разными способами. Один из них состоит в следующем. ДНК патогенного микроорганизма расщепляют с помощью рестрицирующей эндонуклеазы и клонируют в плазмидном векторе. Затем проводят скрининг рекомбинантных плазмид с использованием геномной ДНК как патогенного, так и непатогенного штаммов. Те плазмиды, которые содержат последовательности, гибридизующиеся только с ДНК патогенного штамма, составляют основу видоспецифичных зондов. После этого проводят ряд дополнительных гибридизаций с ДНК, выделенными из различных организмов, чтобы удостовериться, что потенциальные зонды не дают с ними перекрестной гибридизации. Для определения чувствительности метода каждый из зондов проверяют также на модельных образцах, в том числе и на смешанных культурах. [c.188]

В изолированных ядрышках ДНК по крайней мере частично связана с организатором ядрышка. Если бы гены, ответственные за образование рибосомной РНК, находились в ДНК ядрышка, количество рибосомной РНК, связанной при насыш,ении, превышало бы те 0,3%, которые найдены в опытах с целой геномной ДНК. Однако было обнаружено, что в участках ядрышковой ДНК, способных к гибридизации с рибосомной РНК, такого обогаш ения не происходит (табл. 12). По-видимому, гены, ответственные за образование рибосомной РНК, рассеяны по геному и в основном находятся во внеядрышко-вом хроматине. Рибосомная РНК, синтезированная этими генами, перемещается каким-то неизвестным пока образом в ядрышко, где она одевается рибосомным белком. В любой данный момент в ядрышке содержится смесь полностью завершенных 808-рибосом, 603- и 408-субъединиц, а также рибосомного белка, еще не связанного с РНК. Рибосомы, выделенные из ядрышек, неспособны осуществлять синтез белка вероятно, это объясняется тем, что они не имеют доступа к информационной РНК. [c.42]

С обнаружением отдельных генов или специфических геномных последовательностей связаны прежде всего возможности анализа микробных сообществ без выделения и идентификации отдельных его членов в чистых культурах. Методы основаны на экстракции из почвенных, осадочных или водных образцов тотальной ДНК, ее очистки и анализа с помощью градиентных гель-элект-рофорезов — термического и денатурирующего (ТООЕ/ООСЕ). Основной трудностью при экстракции тотальной ДНК является ее отделение и очистка от гуминовых веществ почвы. Однако методы, позволяющие проводить такую очистку, постоянно совершенствуются. [c.256]

Прямое выделение фрагментов генома, соответствующих зонду, сопряжено с практическими трудностями, и для выделения отдельных генов используют эффективный метод с обратным порядком стадий, когда вначале проводят клонирование генома. Затем проводят отбор клона(ов), содержащего специфическую последовательность. Векторы, несущие ДНК, полученную из генома, называют клонами геномной или хромосомной ДНК (в отличие от клонов кДНК, являющихся копиями мРНК). [c.243]

Еще более важным обстоятельством представляется то, что неопластическая трансформация происходит и при трансфекции клеток линии NIH3T3 с помощью ДНК из нормальных клеток. Причиной этого явления может быть аномальная экспрессия нормальных генов. Трансформирующая способность ДНК из нормальных клеток может быть показана в экспериментах двух типов. Во-первых, при использовании для трансформации последовательностей ДНК из нормальных клеток, гомологичных вирусным онкогенам ras и mos, которые способны индуцировать неопластическую трансформацию. Во-вторых, при трансфекции тотальной геномной ДНК, выделенной из различных нормальных клеток животных. [c.325]

Определить количество копий плазмиды в клетках трансформированного штамма можно разными методами, но все эти. методы предполагают выделение суммарной дрожжевой ДНК с последуюш,им определением соотношения плазмидной и геномной ДНК. Относительно простой способ оценить число копий высококопийной плазмиды — сравнение интенсивности окрашивания бромидом этидия рестрикционных фрагментов, соответствующих плазмидной ДНК и ДНК рибосомных повторов в суммарной геномной ДНК. Если суммарную ДНК из трансформированных дрожжей обработать рестриктазой, расщепляющей плазмиду и выщепляющей рибосомный повтор, соответствующие рестрикционные фрагменты можно визуализировать, окрашивая бромидом этидкя агарозный гель после электрофореза. В УФ-свете эти полосы отчетливо высвечиваются над фоновым свечением всех остальных окрашенных бромидом этидия гетерогенных по длине рестрикционных фрагментов. В ДНК гаплоидной дрожжевой клетки содержится приблизительно 140 копий рибосомных последовательностей, содержание же плазмидной ДНК может быть оценено количественно при помощи денситометриче-ск го сканирования фотонегативов, полученных при съемке геля. Интенсивность окрашивания нормализуют относительно длины [c.232]

Две серин мутантов штамма WSN, полученных в Канберре [141] и в Нью-Йорке [94, 248], а также мутанты ХЗЗИ, выделенные в Токио [271], не предназначались для изучения геномных сегментов РНК. Поэтому, несмотря на то, что был проведен фенотипический анализ этих мутантов, представляется затруднительным скоррелировать функцию и структуру, и эти ранние работы не рассматриваются в нашем обзоре. Превосходное обобщение фенотипических характеристик этих трех серий мутантов было сделано L. Hightower и М. Bratt [92]. [c.201]

В реципиентных клетках ДНК плазмиды, содержащей селективный маркер, лигируется с донорной геномной ДНК. Эта приводит к маркированию последовательности ДНК клетки млекопитающего и может упростить выделение донорного гена после нескольких повторных трансфекций [47]. [c.28]

Матричная ДНК. Мы считаем, что для амплификации в ПЦР можно использовать геномную ДНК, выделенную различными методами (см., например, [24]). После выделения следует приготовить исходный раствор с концентрацией 100 мкг/мл. Обрабатывать его рестриктазами необязательно. Чтобы подготовить клонированные препараты ДНК для ПЦР, обработайте плазмидную ДНК рестриктазой, которая расщепляет участки ДНК, внешние по отношению к амплифицируемому сайту. Это уменьшит напряжение цепи ДНК, обусловленное суперскрученностью. После удаления рестриктазы фенольной экстракцией и осаждения в этаноле растворите образцы ДНК в ТЕ-буфере и доведите концентрацию до 100 мкг/мл. Очень [c.142]

Джеффризу с соавторами [14] удалось впервые показать, что зонды на основе кор-последовательности ГВР могут быть использованы для одновременного выявления большого количества соответствующих генетических локусов. С помощью зонда, синтезированного путем тандемного лигирования 33 повторяющихся элементов ГВР из гена человеческого миоглобина, они обнаружили на Саузерн- блотах, несущих гидролизат геномной ДНК человека, картину из большого числа полос. Некоторые из них оказались полиморфными шоследовательностями. Для выделения этих родственных участков исследователи отобрали из геномной библиотеки соответствующие клоны, используя в качестве зонда при гибридизации в мягких условиях конкатенированные повторы из гена миоглобина. Когда же эти выделенные клоны, в свою очередь, выступили в роли зондов, с помощью некоторых из них в геномной ДНК удалось выявить сложную картину гипервариабельных полос. Клоны содержали последовательности, имеющие области гомологии с тандемными повторами миоглобиновых ГВР, которые и представляли собой общие для этой группы кор-последовательности. Последовательности этого семейства были названы минисателлитами. Для изучения доступны два из них, являющиеся вариантами основной кор-последовательности. Соответствующие зонды, названные 33.6 и 33.15, существуют в виде рекомбинантных форм векторов, полученных на основе бактериофага М13 [17] (рис. 1). Каждая из них выявляет около 15 высокополиморфных полос в диапазоне 4—20 т.п.н. Среднее значение гетерозиготности по [c.192]

Рис. 5. Применение метода геномной дактилоскопии для сравнения ДНК из нормальной и неопластической тканей. На автографе представлены образцы ДНК, выделенной из периферической крови (В), нормальной слизистой (М) и опухолевой ткани (Т), полученных от трех больных с злокачественными опухолями желудочно-кишечного тракта. ДНК (Ю мкг) была гидролизована Hinll и разделена электрофорезом в 1,0 /о-ном агарозном геле при 2 В/см в течение 48 ч, после чего перенесена на найлоновую мембрану и гибридизо-вана с пробой на основе минисателлита 33.15. У первого пациента в отпечатке опухолевой ДНК наблюдается отклонение от нормы в виде двух новых полос (а, Ь). У второго пациента полоса (с) присутствует в ДНК лейкоцитов периферической крови и в ДНК нормальной слизистой толстой кишки, но отсутствует в ДНК, выделенной из клеток опухоли толстой кишки. У третьего пациента новая полоса (d) появилась в отпечатке ДНК, выделенной из клеток опухоли желудка. Как и ожидалось, отпечатки ДНК нормальных лейкоцитов и ДНК клеток нормальной слизистой не отличаются, В трех случаях появление новой полосы сопровождалось падением интенсивности высокомолекулярной полосы, следовательно, механизм появления новой полосы в субпопуляции опухолевых клеток может заключаться в неравном кроссинговере, приводящем к потере родительским аллелем нескольких копий повтора и, следовательно,

Препараты нуклеиновых кислот необходимы для идентификации и выделения генов в процессе генно-инженерных манипуляций, а также для изучения организации и экспрессии генов на молекулярном уровне в трансформированных растениях, В первом случае высокомолекулярная очищенная ДНК и интактная РНК необходимы для получения соответственно геномных библиотек и библиотек ДНК. Подробно методики клони-)ования генов и их анализа описаны в других пособиях [1, 8], 7осле того как изучаемый ген клонирован и его структура установлена, его можно ввести в растения (в неизменном или модифицированном виде) с помощью векторов типа DMGT или векторов, сконструированных на основе Ti-плазмид (гл. 1,2 и 3). [c.236]

Качество электрофореза проверяют с помощью хемископа ), а затем гель фотографируют камерой Поляроид , снабженной красно-оранжевым фильтром. На рис. 5.1 показаны полностью рестрицированные и разделенные путем электрофореза образцы ДНК из разных источников. Полосы калибровочных фрагментов ДНК (ДНК фага 1, рестрици-рованная HitidWl) должны быть четкими и хорошо разделившимися (дорожка 1), чтобы при необходимости можно было бы построить калибровочную кривую. Если полосы разделяются плохо, разрешение можно повысить либо увеличив время, либо подобрав соответствующую концентрацию агарозы ") ). Препараты плазмидной ДНК, обработанной рестриктазой (дорожка 2), должны достаточно хорошо разделиться, чтобы дальнейшую работу, например приготовление проб (разд. 5.6) либо выделение определенных фрагментов (разд. 1.5), можно было бы проводить без затруднений и иметь незагрязненные препараты. При электрофорезе рестрицированной тотальной ДНК агробактерий обычно видно множество полос различной интенсивности (дорожка 3), тогда как при рестрикции геномной ДНК растительного или животного происхождения (дорожка 4) [c.283]

В этой главе мы подробно опишем методы, используемые нами в настоящее время для конструирования и скрининга космидных библиотек, а также для опытов типа прогулка вдоль хромосомы . Прогулка вдоль хромосомы определяется как метод, используемый для выделения фрагментов ДНК, соседних с данным районом клонированной ДНК. В большинстве случаев такая прогулка осуществляется с помощью скрининга геномных библиотек, полученных из частично гидролизованной ДНК, с использованием меченого уникального рестрикционного фрагмента, выделенного из концевой области клонированного района. Таким образом получают клоны, содержащие перекрывающиеся фрагменты ДНК, и после рестрикционного картирования и соответствующей ориентации фрагментов материал этих клонов может использоваться для продолжения такой прогулки . [c.17]

Выделенные фрагменты ДНК проверяют с помощью гибридизации с геномным саузерн-блотом. Гибридизацию проводят в присутствии немеченой эукариотической ДНК (50 мкг/мл), которая является конкурентом по отнощению к примесным повторяющимся последовательностям ДНК, присутствующим в зонде (разд. IV, Б). Далее, для того чтобы оценить чистоту зонда и подтвердить его локализацию на карте, проводят гибридизацию с блотом, содержащим рестрикционные фрагменты космидного клона. Фильтр, на котором идентифицировали малокопий-ные последовательности, может быть использован повторно, после того как меченую ДНК мыши отмыли в процессе двух 15-минутных инкубаций в растворе 0,lXSS , 0,1%-ноге ДСН при 90 °С. Выделенный фрагмент можно использовать для скрининга космидной библиотеки лишь в том случае, если оба эксперимента, включающие блот-гибридизацию по Саузерну, дают удовлетворительные результаты (нуклеотидная последовательность должна быть однокопийная и достаточно свободная от примесных рестрикционных фрагментов). [c.35]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология