Клонирование условия

Задачи планирования сложных лабораторных экспериментов состоят в разработке плана достижения цели эксперимента, плана выполнения конкретных лабораторных опытов и использования необходимых приборов на основе анализа сущности изучаемых физико-химических явлений структуры и свойств исследуемого вещества, а также возможных физико-химических условий проведения опытов 7, 16]. Например, в молекулярной генетике при планировании экспериментов по клонированию генов необходимо составить план и выбрать конкретные опыты, обеспечивающие встраивание гена, кодирующего желаемый белок, в генетический аппарат бактерии, чтобы последняя воспроизводила такой ген. [c.36]

Зонды для скрининга геномной библиотеки можно получить по крайней мере двумя способами. Во-первых, можно использовать клонированную ДНК близкородственного организма (гетерологичный зонд). В этом случае условия гибридизации нужно подбирать таким образом, чтобы она могла происходить при существенном расхождении между нуклеотидными последовательностями зонда и искомой ДНК это позволяет решить проблемы, связанные с заведомым различием между ДНК - источником зонда и исследуемой ДНК. Во-вторых, зонд можно получить методом химического синтеза, основываясь на известной аминокислотной последовательности белкового продукта искомого гена. [c.67]

К сожалению, в результате ошибочного спаривания праймера заданной длины с более чем одним участком внутри вставки могут быть получены неоднозначные результаты. Чтобы избежать этого, используют праймеры длиной не менее 24 нуклеотидов и стараются строго соблюдать условия отжига. Именно таким образом были секвенированы фрагменты ДНК, клонированные в бактериофаге X (-20 т. п. н.) или в космидном векторе (-40 т. п. н.). [c.93]

При наличии в клетке плазмиды часть энергетических ресурсов расходуется на ее репликацию, транскрипцию и синтез белков, которые она кодирует. При этом, как правило, многокопийные плазмиды требуют больше энергии, чем мал око-пийные, и в результате часть клеток в процессе роста популяции утрачивает плазмиды. Клетки, лишившиеся своих плазмид, обычно растут быстрее тех, в которых они сохранились, и в конечном счете оказываются в культуре преобладающими. По прошествии нескольких генераций это отражается на количестве синтезируемого продукта клонированного гена. Разработано по крайней мере два подхода к решению этой проблемы. В лабораторных условиях для сохранения плазмид клетки выращивают в присутствии антибиотиков или метаболитов, обеспечивающих рост только тех клеток, в которых есть плазмида. Однако добавление антибиотиков и каких-то других веществ в культуры, выращиваемые в больших объемах, или в промышленные ферментеры приводит к значительному удорожанию конечного продукта. Особенно важно, чтобы клонированные гены сохранялись, не утрачиваясь и не передаваясь другим микроорганизмам, в том случае, когда сконструированный микроорганизм предназначен для использования вне стен лаборатории. Он должен не только оставаться эффективным, но и быть экологически безопасным. Включение клонированной ДНК в хромосомную ДНК хозяйского организма позволяет обойтись без плазмид и избежать утраты плазмидных генов. [c.123]

Состав и прочность клеточной стенки зависят от условий культивирования, скорости роста клеток, фазы, на которой они собираются, условий хранения сконцентрированных клеток и от того, экспрессировал ли выделенный микроорганизм клонированный ген. [c.365]

Метод ДНК-пол имера 3но г о копирования в присутствии терминирующих аналогов три-фосфатов (метод Сенгера). Этим методом чаще всего анализируются фрагменты ДНК, клонированные в одноцепочечных фагах, хотя в настоящее время разработаны варианты, применимые и к двухцепочечным ДНК. Прн этом исследуется не сам фрагмент, а комплементарная ему ДНК, которая синтезируется с помощью ДНК-полимеразы в условиях, приводящих к набору продуктов разной длины, содержащих одинаковый 5 -концевой участок, а на [c.325]

Успехи молекулярной биологии и генетики открывают совершенно новые возможности для получения тетрапиррольных соединений. Использование операции клонирования соответствующих генов позволяет резко увеличить количество ферментов, участвующих в метаболизме порфиринов, и уже сегодня значительно повышает эффективность искусственного синтеза витамина В12, гема и других природных тетрапирролов. Синтез проводится в контролируемых условиях путем смешения различных ферментов, необходимых для получения целевого продукта. Такого рода технологии активно разрабатываются и осваиваются учеными многих стран мира и позволяют получать кроме порфиринов многие другие биологически активные вещества. [c.228]

Становление личности не только базируется на биологической наследственности, но и определяется социокультурной средой. При клонировании индивида невозможно воссоздать все те условия воспитания и обучения, которые сформировали личность его прототипа. Однако все-таки если клон — близнец выдающейся личности, у него, возможно, имеется преимущество, заключающееся в том, что с самого начала жизни будет известно, какими способностями он наделен. [c.499]

Поэтому для создания удобной библиотеки путем клонирования рестриктов пользуются приемом, так регулирующим частоту внесения разрывов, чтобы получились более длинные фрагменты. Для этого используют фермент с короткой (4 п. н.) последовательностью узнавания в условиях, обеспечивающих частичную рестрикцию [c.243]

Новые методы работы с ДНК позволяют также значительно усовершенствовать методы создания вакцин против различных вирусных заболеваний человека и животных. Такие новые способы, включая клонирование и определение нуклеотидной последовательности ДНК вируса, применяли при разработке вакцин против ящура-одной из наиболее распространенных в мире тяжелых болезней свиней и крупного рогатого скота. Современные вакцины, приготовленные традиционным способом, используют инактивированные или ослабленные препараты, которые, однако, иногда содержат патогенные вирусы, что может приводить к вспышкам болезни. Кроме того, некоторые штаммы вирусов при культивировании в лабораторных условиях не достигают кон- [c.288]

Как обсуждалось в гл. 13, наследственная информация, заключенная в нуклеотидной последовательности ДНК, сохраняется неизменной благодаря действию сложных метаболических механизмов, обеспечивающих осуществление репликации и репарации. Мутации могут быть результатом ошибки на любом из многочисленных последовательных этапов этих процессов. Мутагенные факторы способны изменять как непосредственно структуру ДНК, так и структуру ферментов, прямо или косвенно участвующих в соответствующих метаболических процессах. Для понимания механизмов мутаций требуется знание нуклеотидной последовательности гена дикого типа и мутантного гена. Без этого невозможно понять связь между изменениями, происходящими в структуре ДНК и действием конкретных факторов или условий среды, вызывающих мутации. Современные методы клонирования генов сделали возможным прямое определение нуклеотидной последовательности ДНК. Однако еще совсем недавно при изучении молекулярной природы мутаций приходилось анализировать аминокислотные замены в белках, синтезируемых мутантными генами, а затем с помощью таблиц генетического кода выявлять изменения в нуклеотидной последовательности. [c.8]

Первичным условием при выборе векторов должно быть наличие подходящих для клонирования сайтов (обсуждавшихся в разд. 2.1.4.1). Кроме того, существенное значение имеет пра- [c.42]

Краткость и небольшой объем данного раздела могут послужить свидетельством той легкости, с которой ретровирусные векторы обеспечивают введение клонированных последовательностей в клетки-мишени, при условии, что в руках экспериментатора есть функциональный вирусный препарат. Для фибробластов и клеток многих других типов, экспрессирующих соответствующие поверхностные рецепторы, эффективность инфекции приближается к 100%. Ниже приводится рекомендуемая методика. [c.295]

Один из способов создания библиотеки ДНК состоит в обработке донорной ДНК рестриктазой, уз-наюшей тетрануклеотиды. Такой рестриктазой является БаиЗМ, которая вносит один разрыв примерно на 256 пар оснований. Гидролиз проводят в таких условиях, чтобы происходило лишь частичное расщепление, так что образуются фрагменты всевозможных размеров (рис. 4.10). Частичный гидролиз позволяет клонировать целые гены, однако, поскольку сайты рестрикции расположены не случайным образом, некоторые фрагменты могут оказаться слишком крупными для клонирования. В результате в распоряжении исследователя оказьшается неполная библиотека, что может затруднить или даже сделать невозможным обнаружение искомой [c.63]

Основная цель экспериментов по клонированию генов, которые предполагается использовать в биотехнологии, — подбор условий для эффективной экспрессии в нужном организме-хозяине. К сожалению, сам факт встраивания того или иного гена в клонирующий вектор еще не означает, что этот ген будет экспрессирован. В то же время, чтобы получение коммерческого продукта было экономически оправданным, уровень его синтеза должен быть достаточно высоким. Для достижения эффективной экспрессии уже сконструировано много специфических векторов для этого проводились манипуляции с целым радом генетических элементов, контролирующих процессы транскрипции и трансляции, стабильность белков, секрецию продуктов из хозяйской клетки и т. д. Среди молекулярно-биологических свойств систем экспрессии наиболее важны следующие 1) тип промотора и терминатора транскрипции 2) прочность связывания мРНК с рибосомой 3) число копий клонированного гена и его локализация (в плазмиде или в хромосоме хозяйской клетки) 4) конечная локализация синтезируемого продукта 5) эффективность трансляции в организме хозяина 6) стабильность продукта в хозяйской клетке. [c.105]

Для транскрипции с промотора бактериофага Т7 нужна соответствующая РНК-полимераза. Чтобы можно было использовать этот промотор, ген РНК-полимеразы фага Т7 встраивают в хромосому Е. соИ в составе профага X, поместив его под контроль /ас-промотора. Затем клетки трансформируют плазмидой, содержащей ген-мишень под контролем Т7-промотора, и добавляют в среду ИПТГ. В этих условиях происходит индукция гена РНК-полимеразы Т7, синтезируется РНК-полимераза и происходят транскрипция и трансляция клонированного гена. Часто между временем индукции гена РНК-полимеразы Т7 и началом транскрипции гена- [c.108]

Рис. 6.11. Образование случайно ориентированных тандемных повторов. А. Клонированные гены вырезают из клонирующего вектора с помощью рестрицирующей эндонуклеазы Abel и отделяют от векторной ДНК. . Создают условия, при которых происходит сшивание вырезанных генов. Поскольку нуклеотидные последовательности обоих выступающих концов генов одинаковы, последние могут соединяться в любой ориентации. В результате образуются тандемные повторы из случайно ориентированных последовательностей.

Наличие сильного регулируемого промотора -это очень важное, но недостаточное условие максимизации количества продукта клонированного гена. Большую роль играют также эффективность трансляции и стабильность самого продукта. В прокариотических клетках разные мРНК не всегда транслируются с одинаковой эффективностью. Различие может составить несколько сотен раз, и в результате в клетке будут присутствовать сотни или даже тысячи копий одних белковых молекул и лишь несколько копий других. [c.118]

Оптимизация синтеза необходимого продукта -серьезная научная проблема. Если речь идет о белках, то для ее решения обычно используют клонированные гены, находящиеся под контролем сильных регулируемых промоторов. Вначале полагали, что для получения нужного количества продукта будет достаточно конститутивной экспрессии клонированного гена. Однако опыт показал, что при непрерывной транскрипции и трансляции клонированного гена истощаются все энергетические ресурсы клетки и ее рост замедляется. Чтобы приурочить экспрессию клонированного гена к определенной фазе роста, можно использовать механизм индукции. Для этого вначале выращивают клетки в оптимальных условиях до относительно высокой плотности, а затем индуцируют транскрипцию, либо изменяя температуру, либо добавляя в среду тот или иной химический индуктор в зависимости от природы промотора (например, изопропил-Р тиогалактопиранозид). [c.360]

Существенной проблемой является повышение выхода жизнеспособных реконструированных эмбрионов и взрослых клонированных животных. Необходимым условием для решения данной проблемы является выяснение влияния методических приемов на продолжительность жизни и функциональные характеристики животных. Кроме того, для клонирования животных очень важно снизить риск дефективного развития реконструированной яйцеклетки, главной причиной которого может быть неполное репрограммирование генома донорского ядра. Необходимо отметить, что в природе встречаются случаи естественного клонирования человека — это однояйцевые, или монозиготные, близнецы — настоящие клоны с одним и тем же геномом, возникающие при разделении одной зиготы на ранней стадии. [c.499]

Доступность очищенных ДНК-полимераз и химически синтезированпых ДНК-олигоиуклеотидов сделала возможным быстрое клонирование специфических последовательностей ДНК вне живой клетки. Методика, известная под названием полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяет амплифицировать ДНК из какого-нибудь выбранного участка генома более чем в миллион раз, при условии, что нам известна хотя бы часть его нуклеотидной последовательности. Участки этой последовательности, окружающие выбранную для амплификации область, используют для того, чтобы приготовить по ним два синтетических ДНК-олигонуклеотида, каждый из которых комплементарен одной из двух цепей молекулы ДНК. Эти олигонуклеотиды служат затравками при синтезе ДНК in vitro катализируемом ДНК-полимеразой опи определяют концы получаемого фрагмента ДНК (рис. 5-89, AJ. [c.341]

Клетки нз всех лунок, оказавшиеся при скрининге положительными, надо субкультивпровать. Для этого переносите содержимое этих лунок в 24-луночиый планшет и добавьте в каждую лунку по 0,5 мл свежей среды. Клетки из такого планшета могут служить источником для клонирования клеток данной гибридомной линии кроме того, их можно рассеять на чашке Петри диаметром 90 мм и заморозить. Если слияние оказалось очень удачным, можно сразу не справиться с размножением и клонированием слишком большого количества клеток. В такой ситуации лучше выбрать только пять или десять положительных колоний для немедленного их размножения, а остальные заморозить до проведения дальнейших исследований. После размножения колоний в планшете с 24 лунками скрининг следует повторить и, кроме того, провести и более жесткий скрининг другим способом. Если в результате слияния во многих лунках наблюдается рост клеток и обнаруживаются антитела к -галактозидазе, но не обнаруживается антител к белковому продукту встроенного фрагмента, тогда единственно, что остается делать, — это повторить слияние в тех же условиях, в которых проводилось предыдущее. Если, однако, в результате слияния вообще образуется небольшое число клонов гибридных клеток, тогда стоит попробовать внести изменения в методику слияния. К ним относятся использование так называемого питающего слоя для роста клеток и внесение в среду добавок. [c.192]

Техника рекомбинантной ДНК открыла еще одну возможность в освоении пути экспрессии клонированных генов вируса гриппа в прокариотах и эукариотах. Эти исследования имели две основные цели 1) получение больших количеств чистых поверхносд -ных антигенов (НА и КА) применительно к проблеме их дальнейшего использования в качестве вакцин 2) изучение в клетках прокариотов и эукариотов биосинтеза, структуры и функции индивидуальных белков вируса гриппа дикого типа или мутантов. Поскольку эти белки в естественных условиях кодируются геномом минус-цепочечной РНК, ранее было невозможно управлять их первичными структурами путем направленных изменений кодирующих их последовательностей нуклеотидов. [c.161]

Обязательным условием генетических исследований является тщательная селекция подходящих систем вирус — клетка хозяина и выделение мутантов из однократно клонированного потомства вируса дикого типа [55]. В случае вируса гриппа эти требования нелегко удовлетворить по следующим причинам а) несмотря на то что множество различных типов клеток может функционировать в качестве хозяина для вируса гриппа, большинство комбинаций вирус — клетка приводит к усилению цикла абортивной репликации, и вирус не образует бляпгек б) высокие скорости мутабиль-ности и генетической изменчивости генома вируса гриппа поднимают особые вопросы по определению природы популяции вируса дикого типа. [c.188]

Вместе с тем имеются данные о выживании ГММО в окружающей среде. Установлено, что бактерии Е. соИ, содержащие рекомбинантные плазмиды с клонированными генами (генами устойчивости к ампициллину и генами синтеза фермента люциферазы), при определенных условиях способны выживать в лабораторных водных микроэкосистемах. Рекомбинант- [c.242]

Хотя некоторые клеточные гены, включенные в состав вирусного генома, стали онкогенами, ни их структура, ни их функции в результате такого перемещения существенно не изменились. Например, онкоген вируса саркомы Рауса и его ген-предшественник в нормгшьной клетке кодируют сходные ти-розиновые протеинкиназы, связанные с плазматической мембраной. В случае некоторых онкогенов методом клонирования ДНК был вьщелен клеточный ген-предшественник. Если такой ген ввести обратно в клетку при условиях, благоприятных для его экспрессии, то нормальная клетка превращается в опухолевую [c.156]

Смотреть страницы где упоминается термин Клонирование условия: [c.243] [c.122] [c.120] [c.137] [c.209] [c.340] [c.444] [c.530] [c.506] [c.194] [c.221] [c.500] [c.215] [c.229] [c.217] [c.175] [c.183] [c.202] [c.240] [c.41] [c.15] [c.207] [c.61] [c.41] [c.111]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология