Нуклеазы чувствительность к ним

Выделить нативную молекулу ДНК (рис. 3.2) из большинства источников, в частности хромосом, чрезвычайно трудно из-за высокой чувствительности молекулы ДНК к нуклеазам тканей и гидродинамической деструкции . [c.111]

Биохимический метод определения нуклеиновых кислот в гомогенатах гонад менее показателен, ибо, как установлено, например, Г. М. Егоровой при воздействии свинца нуклеиновые кислоты могут перераспределяться между различными генерациями половых клеток — в одних слоях увеличиваться, в других уменьшаться. Таким образом, общие изменения могут оказаться нивелированными. По нашим данным, более чувствительным тестом является активность нуклеаз (метод [c.252]

Общую протяженность двухцепочечных участков можно установить, исходя из физических свойств молекулы, так, как это описано в следующем разделе. Однако на основе таких измерений нельзя узнать, какие именно индивидуальные отрезки участвуют в спаривании. Одноцепочечные и двухцепочечные участки РНК различаются по чувствительности к некоторым нуклеазам. Это дает возможность установить, какие конкретные участки молекулы вовлечены в спаривание. Такие данные, однако, имеют ограниченное применение, и в основном анализ вторичной структуры РНК зависит больше от развития теоретических представлений, чем от информации, получаемой экспериментальным путем. [c.34]

Участок матрицы, ассоциированный с ферментом, составляет около 60 нуклеотидов, однако область локального расплетения цепей будет короче, и точно оценить ее размер довольно трудно. Судя по чувствительности ДНК в открытом комплексе к нуклеазе, специфичной к одноцепочечным участкам, длина расплетенного участка равна 12 парам нуклеотидов (гл. И). Если же РНК-полимераз-ная реакция протекает на кольцевых двуспиральных молекулах ДНК, то протяженность неспаренного участка ДНК составляет 17 нуклеотидных пар. [c.135]

Возможно, весь промотор является участком связывания фермента, но дополнительные последовательности в меньшей степени ассоциированы с ферментом или менее защищены и, следовательно, чувствительны к нуклеазе, хотя прочно связанные последовательности экранируются ферментом. В этом случае разногласия между строением экранируемого фрагмента и его неспособностью к повторному связыванию фермента отражают геометрию взаимодействия РНК-полимеразы и ДНК. [c.141]

Каждая ступенька лестницы представляет собой ДНК, соответствующую определенному числу нуклеосом. Таким образом, можно принять, что существование лестницы , кратной 200 п. н., указывает на нуклеосомную организацию ДНК. При обработке нуклеазой микрококков образуется лестница только примерно из 2% ядерной ДНК, которая переходит в кислоторастворимую фракцию (деградирует до мелких фрагментов). Таким образом, реагирует только часть ДНК, по-видимому соответствующая особенно чувствительным областям. [c.362]

Четко ограниченный размер полосы ДНК, образованной в результате первого расщепления нуклеазой микрококков, говорит о том, что область, непосредственно доступная для действия фермента, ограничена. К ней относится только часть каждого линкера. (Если бы вся линкерная ДНК была чувствительна, размер полосы колебался бы в интервале от 146 п.н. до отрезка, превышающего размер повторяющейся единицы). Но, после того как линкерная ДНК разрезана, оставшаяся часть становится чувствительной и довольно быстро расщепляется ферментом. [c.363]

Какова физическая природа минимальной нуклеосомы (нуклеосомного кора) и линкера Эти термины являются операциональными определениями для обозначения областей, относительно более и менее чувствительных к обработке нуклеазой. Из этого нельзя делать каких-либо выводов об их действительной структуре. Это не означает, в частности, что линкерная ДНК имеет более вытянутую форму, С другой стороны, путь ДНК в нуклеосоме может быть непрерывным без каких-либо четких различий между этими областями мономера. В действительности это условное рабочее предположение, которое часто делают, пытаясь перейти от структуры минимальной нуклеосомы к структуре нуклеосом. С другой стороны, возможно, что путь линкерной ДНК отличается от пути ДНК в минимальной нуклеосоме, о чем свидетельствуют заметные вариации в длине линкеров. [c.363]

Два типа данных независимо говорят о том, что ДНК, очевидно, лежит на поверхности нуклеосомы, обвиваясь снаружи вокруг гистонового октамера. Согласно биофизическим данным, диаметр белкового компонента нуклеосомы меньше, чем диаметр витка ДНК. Биохимические данные показывают, что ДНК чувствительна к нуклеазам в участках, расположенных через определенные интервалы (см. ниже). [c.363]

Если расположение нуклеосом на ДНК происходит случайным образом, то все сайты, чувствительные к нуклеазе микрококков, рано или поздно окажутся в линкерной области, став доступными для действия фермента. Картина расположения полос при расщеплении хроматина и ДНК будет одинаковой. Но, если нуклеосомы лежат в упорядоченных местах (фазированы), некоторые сайты, чувствительные к нуклеазе микрококков, будут вне пределов досягаемости, так как окажутся в пределах минимальной нуклеосомы. Тогда отдельные полосы, обнаруживаемые при электрофорезе расщепленной ДНК, будут отсутствовать в электрофореграммах расщепленного хроматина. Если же при образовании нуклеосом возникают новые чувствительные сайты, то в электрофореграммах расщепленного хроматина можно будет обнаружить новые полосы. Таким образом, различие в расположении полос при расщеплении контрольной ДНК и хроматина доказывает существование фазирования нуклеосом. Такие эксперименты действительно были выполнены. [c.379]

Нуклеосомная ДНК относительно нечувствительна к нуклеазе микрококков. Даже в изолированных частицах минимальной нуклеосомы только часть связей в ДНК оказывается чувствительной к ДНКазе I, делающей одноцепочечные разрывы (гл. 29). Напомним, что каждая нуклеосома существует не изолированно, а по соседству с другими, и рассмотрим два оборота ДНК, закрученные вокруг нуклеосомы. Все это выдвигает на первый план вопрос о том, имеет ли РНК-полимераза достаточный доступ к ДНК, если нуклеиновая кислота как обычно закручена вокруг нуклеосомы. Трудно себе представить, что в процессе транскрипции полимераза может следовать по ДНК вокруг нуклеосомы. [c.379]

Сайты мутаций узнаются специальными нуклеазами, которые вырезают поврежденный участок из ДНК, а затем другие ферменты синтезируют замещающую последовательность. Вместе эти активности составляют репарирующую систему. Наряду с репарацией повреждений путем вырезания и замещения существуют системы, исправляющие вредные последствия репликации поврежденной ДНК. Такие исправляющие системы родственны системе генетической рекомбинации. Клетки Е. соИ, лишенные исправляющих систем, становятся чрезвычайно чувствительными к определенным типам повреждений. Репарирующие и исправляющие системы наиболее полно охарактеризованы у Е. соИ, однако их аналоги в клетках эукариот, вероятно, играют такую же важную роль. Можно предположить, что определенные болезни человека возникают в результате неправильного функционирования специфических репарирующих систем. [c.431]

Рис 9-51 Обработка хроматина панкреатической ДНКазой I. Вначале фермент разрезает сайты обладающие повышенной чувствительностью к нуклеазе (не показано), затем деградации подвергается последовательность ДНК, в которую входят активно [c.129]

В пробы вносят нуклеазу S1 (см. методику с нуклеазой S1). Число импульсов в минуту устойчивой к нуклеазе S1 ДНК откладывают против температуры. Температуру, при которой 50% двухцепочечных комплексов становятся чувствительными к нуклеазе S1 [c.146]

Регуляторные ДНК-связывающие белки прокариот вызывают заметные изменения конформации ДНК. При рентгеноструктурном исследовании комплекса регуляторного белка TFIHA со своим участком ДНК оказалось, что двойная спираль находится в А-форме. Другие изменения (изгибы и изломы двойной спирали) можно обнаружить с помощью электронной микроскопии, электрофореза ДНК-белковых комплексов, а также при действии нуклеаз. Связанный белок защищает от расщепления 15—30 п. о. в месте связывания и порождает два участка повышенной чувствительности к нуклеазам с обеих сторон от места связывания. Тонкий анализ мест гиперчувствительности в хроматине эукариот показал, что они имеют точно такую же структуру — две гипер-чувствительные точки, разделенные защищенны.м участком. [c.257]

Общим методом детектирования нуклеиновых кислот в элюатах является измерение УФ-поглощения при 260 нм. В тех, случаях, когда нуклеиновые кислоты вследствие включения меченых предшественников содержат радиоактивную метку (Щ, или Р), спектрофотометрия дополняется более чувствительным методом определения радиоактивности. Кроме того, качественный и количественный анализы фракций можно проводить колориметрически, с реактивами, используемыми обычно для определения нуклеиновых кислот в экстрактах из тканей [32] орцина в случае определения РНК [33] и дифениламина в случае определения ДНК [34]. Для этих же целей используют специфические нуклеазы (ДНКаза, РНКаза, РНКаза Н, нуклеаза из Кеигоз-рога, фермент Лемана и т. п.) [c.68]

Как видно из этой схемы, концевой нуклеозид можно идентифицировать только в случае отсутствия на концах олиго-или полинуклеотида фосфатных групп. При наличии фосфори-лированных концов фермент будет неактивен, или же концевой нуклеозид окажется фосфорилированным и, следовательно, неотличимь1м от других образующихся нуклеотидов. Обработка полинуклеотида фосфомоноэстеразой, не содержащей примесей нуклеаз (например, высокоочищенной щелочной фосфатазой Е, oli А-19), приводит к полимеру, не этерифицированному по концевым нуклеозидам и, таким образом, чувствительному к действию любой из экзонуклеаз. [c.46]

Опыт работы с С-специфичной нукле ой из сырых препаратов щелочной фосфатазы показывает, что она пригодна для расщепления олигонуклеотидов и небольших нуклеиновых кислот. При фракционировании по длине цепи продуктов действия С-нуклеазы на такие большие нуклеиновые кислоты, как РНК TMV, не удается достигнуть такого разрешения, как в случае панкреаттеского или Т. -РНК-азного гидролизатов. Причина этого не ясна. Возможно, не все связи, теоретически чувствительные к этому ферменту, гидролизуются, или же часть олигонуклеотидов, оканчивающихся цитидиловой кислотой, остается в виде промежуточных 2 ,3 -циклофосфатов, а не З -фосфомоноэфиров, Любая из этих возможностей должна привести к усложнению смеси [c.293]

Таким образом, явление ограничения и модификации, контролируемое хозяином, обусловлено двумя отдельными, явно различными функциями генома фага Р1. Фаг Р1 вызывает модификацию ДНК фага А,,, развивающегося в его присутствии. Эта модификация защищает ДНК фага Я от разрушения под действием ограничивающей нуклеазы Р1, которая разрушает обычную немодифицированную ДНК фага А,. Когда фаг Я, содержащий ДНК, модифицированную фагом Р1, заражает нелизогенные бактерии К12, все дочерние копии родительской ДНК фага к неизбежно оказываются немодифицированными, чувствительными к распаду и, следовательно, дают начало ограниченным частицам-потомкам фага Я. Модифицированная же родительская ДНК фага X всегда сохраняет свою устойчивость к распаду и при пересевах снова появляется среди неограниченных фагов-потомков. [c.370]

Чувствительность РНК к нуклеазам — явление обычное, а в случае вирусных РНК, соответствуюш,их по размерам РНК ВТМ, когда для инактивации РНК достаточно разрыва лишь одной связи на 6400 нуклеотидов, присутствие даже следовых количеств нуклеаз или фосфоди-эстераз может сыграть решающую роль в том, насколько успешными окажутся опыты с не защищенной белком вирусной РНК. Для устранения этой опасности были предложены различные методы. В результате предварительной обработки ВТМ комплексообразующими соединениями (например, в результате инкубации с цитратом или ЭДТА) происходит освобождение вируса главным образом от таких нуклеаз, которые обычно адсорбируются на его поверхности. Более широкое распространение получило применение в процессе выделения РНК ингибиторов нуклеаз. Бентонит, представляющий собой поли-кислотную глину, является, по-видимому, по крайней мере таким же эффективным ингибитором, как и другие ноликислотные минералы или полимеры, предложенные позже [142, 455]. Суспензию промытого и отмученного бентонита можно добавлять во время фенольной экстракции до 10—30% (относительно веса вируса). Мелкие частицы бентонита остаются суснендированными в водной фазе, однако от них можно избавиться с помощью высокоскоростного центрифугирования раствора РНК после частичного или полного удаления этилового спирта. [c.58]

Различия в чувствительности к нуклеазам тоже могут быть обусловлены различиями в конформации. РНК фагов QP и I2 имеет более компактную конформацию. Но это происходит, возможно, потому, что еще в известной степени сохраняется то состояние, в котором она находилась в вирусной частице. Об этом свидетельствует тот факт, что обработка ЭДТА, по-видимому, разрушает эту конформацию. [c.108]

ЧТО нуклеиновые кислоты обладают очень большой чувствительностью к различным воздействиям, в особенности к вездесущим нуклеазам, изучение этих инфекционных агентов является нелегкой задачей. Очень часто в распоряжении исследователей нет неоспоримых доказательств, подтверждающих, что определенная болезнь вызвана инфекционной нуклеиновой кислотой, а не каким-то особенно лабильным вирусом. Наиболее доказанным случаем можно считать вирусное заболевание, которое называется веретеновидностью клубней картофеля [911. [c.170]

Единственным убедительным тестом, неопровержимо доказывающим, что инфекционный агент но своей природе представляет собой нуклеиновую кислоту, служит его чувствительность к нуклеазам или фосфодиэстеразам. Находясь внутри вириона, нуклеиновые кислоты более или менее полностью защищены от нуклеаз во внешней среде. Допустим, что при обработке каким-то определенным ферментом инфекционность данного вируса не снижается. Если при такой же обработке препарата нуклеиновой кислоты, полученного из этого же вируса, инфекционность будет утрачена, то можно считать доказанным, что инфекционность не связана с загрязнением препарата остаточиБши" интактными вирусными частицами [144, 1621. [c.177]

Другой тип экспериментов по модификации позволяет непосредственно обнаружить расплетенную область ДНК, входящую в состав бинарного открытого комплекса. При разделении цепей ДНК неспаренные аденины становятся чувствительными к дополнительному метилированию в присутствии ДМС. Если затем фрагмент ДНК освободить от фермента, расплетенная область ренатури-рует, за исключением метилированных остатков аденина, которые теперь содержат метильные группы в положении N 1, принимающем обычно участие в комплементарном взаимодействии оснований. Метильные группы мешают основаниям А узнавать своих партнеров Т. Это несовершенство в спаривании можно обнаружить при помощи фермента нуклеазы 81, которая специфически расщепляет ДНК в любом одноцепочечном участке. Как обычно, результаты такого расщепления анализируют электрофоре-тически, определяя размеры образующегося фрагмента, меченного по концу. [c.147]

Эксперименты, в которых анализируют ДНК на нуклеосомах по ее чувствительности к нуклеазам, проводят по методу, близкому к методу отпечатков (footprint). Таким образом, мы можем связывать утрату реакции в определенном сайте-мишени с такой структурой нуклеосомы, в которой данные положения на ДНК стали нечувствительными. Но какова причина периодического разрезания через 10,7 п.н. [c.367]

Рестриктирующий фермент MspI расщепляет два сайта этой области. Часть фрагментов, образованных этим ферментом, оказывается в виде свободной ДНК, Таким образом, в период транскрипции область, расположенная от — 60 до — 260, становится предпочтительно чувствительной к нуклеазам, [c.390]

Рис. 30.18. Сверхчувствительный сайт р-гло-бинового гена курицы занимает область, чувствительную к нескольким нуклеазам.

Особенно хорошо изучена чувствительная к нуклеазе область мини-хромосомы вируса SV40. Короткий сегмент около точки начала репликации, непосредственно предшествующий промотору для поздней единицы репликации, предпочтительно расщепляется ДНКазой I, нуклеазой микрококков и другими нуклеазами (в том числе рестриктирующими ферментами). По минимальной оценке область предпочтительного расщепления имеет в длину 400 п. н., причем этот фрагмент может быть вырезан в виде свободной ДНК. [c.391]

Состояние мини-хромосомы вируса SV40 можно увидеть под электронным микроскопом. В участке, составляющем до 20% всего образца, заметен пробел в нуклеосомной организации. Это хорошо видно на электронной микрофотографии (рис. 30.19). Пробел длиной около 120 нм (примерно 350 п.н.) с обеих сторон окружен нуклеосомами, занимающими весь остальной геном. Положение пробела можно определить, расщепив кольцевую мини-хромосому с помощью рестриктирующего фермента, для которого известен лишь один сайт-мишень. Видимый пробел соответствует области, чувствительной к нуклеазам. Это прямо показывает, что повышенная чувствительность к нуклеазам коррелирует с отсутствием нуклеосом. [c.391]

Подобный нуклеазочувствительный пробел в нуклеосомной организации найден у родственного вируса полиомы. В этом случае было показано, что различные участки этой области не в одинаковой степени чувствительны к нуклеазам. Внутри чувствительной области размером 260 п. н. находятся два сверхчувствительных сайта и защищенный участок. Карта этой области показана на рис. 30.20. [c.391]

Область вируса SV40 или полиомы, окаймляющая чувствительный к нуклеазе пробел, имеет несколько потенциальных функций, и, следовательно, ее нельзя просто считать структурой, активирующей промотор. Наличие пробела может быть связано с последовательностями элементов усилителя транскрипции (энхансер, enhan er), которые находятся в этой области и которые необходимы для функции промотора (гл. И). [c.392]

ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ К ДЕЙСТВИЮ ДНКазы I САЙТЫ. Небольшая область хроматина, определяемая по ее повышенной чувствительности к ДНКазе I и другим нуклеазам возможно, не содержит нуклеосом. [c.520]

В изучении свойств необычных структур ДПК суш ественно определить одно-нитивые участки, которые являются элементами этих конструкций. В этом отношении наиболее продуктивным оказался ферментативный метод, который позволяет локализовать место атаки однонитевой нуклеазы. Таким образом, например, были обнаружены однонитевые участки крестовидной ДПК, а также показано, что при образовании. Z-формы атакуются границы между ними и В-формой. Оказалось, что однонитевые участки, чувствительные к однонитиевой эндонуклеазе, находятся в важных регуляторных участках генома. [c.226]

Структуру участков хроматина, содержащих гены, клонированные в составе рекомбинантных векторных ДНК, можно изучать непосредственно на интактных ядерных ДНК, в качестве критерия используя различия в чувствительности к действию нуклеаз. Участки ДНК, входящие в область открытых хроматиновых структур, более доступны нуклеазной атаке, чем участки, существующие в виде более компактных структурных образований. [c.221]

Рис. 9-27. Схема, иллюстрирующая прерывание правильной нуклеосом-нон структуры хроматина короткими областями, в которых ДПК необычно чувствительна к обработке ДПКазой 1. В каждом из этих сайтов, сверхчувствительных к нуклеазе, нуклеосомы на ДНК, вероятно,

Получить прямое доказательство того, что активированные рецепторы стероидных гормонов связываются со специфическими генами, было очень трудно, и это удалось сделать лишь в 1983г., когда была разработана технология рекомбинантных ДНК. Она позволила клонировать гены, регулируемые стероидными гормонами, и получать в больших количествах специфические последовательности ДНК Необходимо было еще очистить рецепторные белки, что само по себе является весьма трудоемкой и длительной процедурой. Как только удалось получить рецепторы в очищенном виде, связывающие их последовательности ДНК были картированы in vitro методом футпринтинга (разд. 4.6.6), оказалось, что присоединение рецептора защищает от мягкого расщепления нуклеазами или химическими реагентами фуппу специфических нуклеотидных последовательностей ДНК. Если эти короткие узнаваемые последовательности из гена удалить, то стероидный гормон уже не будет активировать его транскрипцию. Более того, если короткий фрагмент ДНК, который содержит узнаваемую последовательность, слить с другим геном (репортером) и затем перенести в клетку, содержащую рецепторный белок, то соответствующий стероидный гормон будет активировать транскрипцию гена-репортера. Эти эксперименты показывают, что последовательности ДНК, узнаваемые in vitro активированными рецепторами стероидных гормонов, действительно опосредуют действие рецептора в клетке. Гены, чувствительные к стероидным гормонам, как правило, содержат несколько групп узнаваемых последовательностей, обычно расположенных выше (а иногда и ниже ) кодирующей области где-нибудь внутри гена (рис. 12-10). Ввиду значительной структурной гомологии между разнообразными репепторами лля стероидных гормонов близкое сходство распознаваемых ими последовательностей не вызывает удивления. [c.350]

Долю фрагментов ДНК, несорбирующихся гидроксилапатитом или чувствительных к нуклеазе S1, откладывают по оси у, а значения ot — по оси х в логарифмическом масштабе. [c.149]

Защита от воздействия РНКазы, по всей вероятности, наиболее чувствительный и простой метод выявления и анализа специфических РНК [13]. Этот метод позволяет обнаружить даже столь малое количество РНК, как 0,1 пг [13]. Его преимущества по сравнению с использованием нуклеазы 81 [10] сводятся к простоте получения зонда, высокой чувствительности анализа и большей эффективности ферментативной обработки на конечных стадиях (обработка РНКазой вместо нуклеазы 51). По-видимому, на этой стадии гибрид менее чувствителен к избыточной обработке РНКазой, чем к обработке нуклеа-зой 51. [c.30]

Как правило, каждая клетка многоклеточного организма содержит одну и ту же генетическую информацию в виде одной и той же последовательности ДНК. Из этого следует, что различия между типами клеток данного организма должны объясняться дифференцированной экспрессией общей генетической информации. Хроматин, содержащий активные гены (транскрипционно-активный хроматин), отличается по некоторым признакам от неактивного. Нуклеосомная структура активного хроматина видоизменена или, в особо активных областях, вообще отсутствует. ДНК в активном хроматине содержит длинные участки (около 100000 пар оснований), чувствительные к действию нуклеаз (например, ДНКазы I). Чувствительность к ДНКазе I указывает на возможность транскршщии и в некоторых случаях коррелирует с отсутствием 5-метилдезок-сицитидина в соответствующей области ДНК. [c.67]

Внутри большой области активного хроматина обнаружены короткие участки (100—300 нуклеотидов) с еще более высокой (на порядок) чувствительностью к ДНКазе I. Эти, так называемые гннерчув-ствительные сайты, по-видимому, возникают в результате конформационных изменений, которые создают особенно благоприятные условия для действия нуклеазы на ДНК. Такие участки обычно локализованы непосредственно перед активным геном и могут быть обусловлены наличием так называемых энхансерных элементов, усиливающих транскрипцию (см. гл. 39 и 41). Есть основания считать, что во многих случаях транскрипционная активность гена связана с наличием в хроматине гиперчув-ствительного к ДНКазе сайта, непосредственно прилегающего к началу гена. Вероятно, такие сайты обе- [c.67]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология