Электрофорез градиентных гелях

При двумерном разделении белков и пептидов возможны различные комбинации методов электрофорез с градиентным гелем и изоэлектрической фокусировкой [212], гель-фильтрация с изоэлектрической фокусировкой [213], гель-фильтрация с электрофорезом [214], двумерный электрофорез с различными буферными системами [215—218], двумерная хроматография с различными растворителями [219—221] и хроматография в сочетании с электрофорезом или изоэлектрической фокусировкой. Райт и др. [222] оценивали результаты одно- и двумерного разделения сложных смесей белков, подсчитывая число разделенных полос, и установили, что двумерный электрофорез на геле акриламида дает большее число полос, чем периодический или непрерывный градиентный электрофорез на геле акриламида, изоэлектрическая фокусировка или изоэлектрическая фокусировка, сопровождаемая непрерывным градиентным электрофорезом на геле. [c.518]

Денатурирующий градиентный гель-электрофорез [c.128]

Гели с градиентом денатурирующих веществ, перпендикулярным направлению электрофореза, используются для определения характера плавления фрагментов ДНК с неизученными свойствами. Такие гели дают информацию, необходимую при расчете оптимальных градиентов и времени электрофореза для стандартных параллельно-градиентных гелей. В разделе описывается процедура заливки таких гелей. Дополнительные сведения по этому вопросу имеются в работе [20]. [c.156]

В параллельно-градиентных гелях направление градиента концентраций ДНК-денатурирующих веществ совпадает с направлением электрофореза он линейно увеличивается от вершины к основанию геля. Интервал значений концентраций в градиенте выбирается исходя из данных о характере плавления исследуемого фрагмента, полученных с помощью перпендикулярно-градиентного геля. Обычно этот интервал составляет 25% и подбирается так, чтобы образец ДНК начинал плавиться в середине геля. Так, например, параллельно-градиентный гель с градиентом концентраций от 25 до 50% можно использовать при анализе фрагмента ДНК, который плавится при концентрации денатурирующих веществ 37,5%. В таких гелях имеется несколько лунок, так что одновременно в одном геле можно исследовать несколько препаратов ДНК- [c.159]

Профиль плавления фрагмента ДНК определяется электрофорезом в перпендикулярно-градиентном геле. Подобранные условия воспроизводят затем на параллельно-градиентных гелях. Наряду с этим следует проводить эксперименты по выявлению оптимального времени проведения параллельно-градиентного электрофореза. Цель таких опытов — установить продолжительность электрофореза, достаточную для того, чтобы фрагмент ДНК достиг участка геля, в котором концентрация денатурирующего вещества вызывает плавление исследуемого в дан- [c.163]

Обнаружение единичных нуклеотидных замен при помощи денатурирующего градиентного гель-электрофореза [c.173]

Если имеется одноцепочечная кольцевая плазмида, комплементарная РНК- или ДНК-зонду, можно ввести еще один дополнительный этап по связыванию остаточных количеств зонда, не вступивших в реакцию гибридизации [15, 43]. В этом случае после окончания реассоциации добавьте в пробирку 1 мкг одноцепочечной комплементарной кольцевой ДНК и инкубируйте еще 10 мин при 45 °С. Полученные при этом гибридные молекулы в процессе электрофореза остаются на вершине денатурирующего градиентного геля. Эта стадия помогает также уменьшить фон, даже если тестируемая ДНК имеется в избытке. Отметим, что в случае одноцепочечных ДНК-зондов в качестве матрицы-ловушки используется та же самая одноцепочечная ДНК, что служит матрицей для синтеза зонда. [c.173]

Следующий шаг в развитии данного метода — сочетание гель-электрофокусировки с градиентным гель-электрофорезом [418]. ири этом разделение происходит как по величинам р/, так и по молекулярным массам. В этом случае могут представлять интерес методы, применяемые при приготовлении градиентных слоев для электрофореза [199—203, 370, 378]. [c.177]

Электрофоретическому разделению веществ мешает их диффузия. Среда, в которой мигрируют молекулы, сама по себе в какой-то мере препятствует диффузии, однако еще в большей степени можно подавить этот эффект и одновременно увеличить подвижность сравнительно небольших молекул с помощью высокого напряжения (высоковольтный электрофорез). В некоторых случаях гели выполняют роль сит. Например, в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия разделение предварительно дентурированных белков происходит в соответствии с размерами их молекул. При проведении электрофореза в градиентном геле разделяемые вещества мигрируют в направлении уменьшения диаметра пор геля, и поэтому с увеличением расстояния от старта задерживаются все более мелкие молекулы. [c.28]

Электрофорез в капиллярах, заполненных градиентным гелем. Для приготовления градиентных гелей в капиллярах было предложено [1196] погружать их в раствор с предварительно сформированным градиентом концентрации амриламида (5—25%). Скорость погружения капилляра регулировали, используя специальный держатель, связанный через эксцентрик с электромотором. Чтобы избавиться от капиллярного эффекта и получить требуемый градиент, капилляры сначала снизу наполняли буфером для геля, содержавшим 0,2% тритона Х-100, и лишь затем постепенно погружали в градиентный раствор. Предварительно их устанавливали вертикально в прикрепленную к стальному стержню полиэтиленовую трубку с нижиим отверстием, затянутым нейлоновой сеткой. В конце заполнения в систему добавляли 50%-ную сахарозу, которая вытесняла раствор акрилам ида в капилляры и препятствовала его поли-.меризации на нейлоновой сетке [915]. [c.110]

Миро и др. [876] применяли гели с экспоненциальным градиентом концентрации полиакриламида, приготовленные в кварцевых трубках. Это дало возможность проводить прямое денситометрическое сканирование гелей. Чтобы обеспечить стабильность градиента концентрации акриламида во время полимеризации, создавали параллельный градиент концентрации глицерина. ТЕМЭД и персульфат добавляли в концентрациях обратно пропорциональных концентрации акриламида. Гели готовили на буфере, содержащем триэтаноламин, ацетат натрия и ЭДТА (pH 7,4). Электродные резервуары наполняли тем же буфером с добавлением глицерина, ДСН и дезоксихолата. Ядрышковые РНК из клеток НеЬа наносили на гель в объеме 50 и 800 мкл. Если электрофорез продолжался в течение 9 ч, то разделение было лучше в пробе с объемом 50 мкл, однако через 18 ч в обоих случаях были получены одинаково хорошие результаты (рис. 121). Изучение кинетики электрофоретической миграции показало, что в градиентном геле разные виды РНК движутся с той же относительной скоростью, что и в однородном геле. При использовании экспоненциального градиента концентрации от 1,8 до 15% можно в один прием разделить все клеточные РНК и определить их молекулярные массы. [c.379]

При электрофорезе в градиентном геле полипептиды мигрируют до достижения зоны с определенной пористостью, препятствующей их дальнейшему продвижению. Если все комплексы полипептидов с ДСН имеют одинаковую форму, концентрацию ПААГ в этой зоне можно принять характеристической для данной молекулярной массы [97, 99, 101, 137]. Комплекс может частично разрушиться с потерей ДСН, в особенности в области, близкой к равновесному состоянию, однако это не влияет на конечный результат. Объем образца не влияет па ширину белковых зон, тем не менее наносить образец в большом объеме не рекомендуется. При электрофорезе в градиентном ПААГ формирование градиента с высокой воспроизводимостью может быть затруднительным. Однако для этих целей выпускаются преформированные гели высокого качества. [c.28]

Двумерный электрофорез. Проводят электрофорез в первом направлении при рП 8,9 (или ином pH) в присутствии 8 М мочевины, а затем во втором направлении в присутствии ДСН. С целью сужения зон иа границе геля электрофорез во втором направлении проводят в ступенчатой буферной системе. Гель из трубки помещают па слой формирующего геля в торец пластины и фиксируют с помощью агарозы (ко1щентрация ДСН и буфере для образца 17о (масс./об.), см. разд. 1.3Л) [115]. Электрофорез во втором направлении можно вести в непрерывной буферной системе на градие1ггиом геле, тогда сужение зон будет идти вблизи стационарного положения. В этом случае гель из трубки (диаметр 3,5 мм) уравновешивают в течение 30 мин с 100 ил электродного буфера (0,025 М фосфат, pH 7 + + 0,15% ДСН) и помещают на верхний торец готовой (фирменной) пластины градиентного геля (4—27%) (разд. 1.3.1.1), которую предварительно пропитывают ДСН с помощью электрофореза при 50 мА в течение 3 ч. Разделение проводят при 30 мА в течение 15 мин и 50 мА в течение 3,5 ч [114]. [c.45]

Два фрагмента ДНК, различающиеся лишь делецией, инсер-щией или заменой одного нуклеотида, или единственным неспаренным нуклеотидом, можно легко разделить при помощи денатурирующего градиентного гель-электрофореза, ДГГЭ [15, 17— 20, 27, 28]. Принцип метода заключается в разделении двухце-почечных фрагментов ДНК электрофорезом в стандартном акриламидном геле с линейным градиентом денатурирующих факторов — мочевины, формамида или температуры. Ниже приводятся теоретические основы метода. Здесь отметим только, что разделение очень похожих фрагментов в геле происходит из-за разных температур плавления их ДНК. [c.128]

Рис. 4. Выявление единичных нуклеотидных замен методом ДГГЭ. Меченый одноцепочечный ДНК- или РНК-зонд смешивают с двухцепочечной (клонированной, геномной или амплифицированной в ПЦР) ДНК смесь нагревают для разделения цепей. Происходит отжиг зонда с комплементарной ему цепью тестируемого фрагмента, при этом образуются гибридные дуплексы. Если в исследуемом образце имеется мутация, то в гибриде будет однонуклеотидный неспаренный участок. После отжига к смеси добавляют избыток одноцепочечной кольцевой ДНК, комплементарной зонду, для удаления его остатков. Проводят электрофорез смеси в денатурирующем градиентном геле. Гель высушивают и экспонируют с рентгеновской пленкой. Наличие неспаренных участков в мутантных образцах ДНК, изменяющих характер плавления, приводит к тому, что эти фрагменты оказываются в геле ближе к старту вследствие пониженной термостабильности. Преимущество такого метода разделения мо- чекул с неспаренными участками в его повышенной разрешающей способности.

Рис. 9. Гели для оптимизации продолжительности электрофореза (оптимизирующие гели). На каждом рисунке показаны результаты, полученные в параллельно-градиентных денатурирующих гелях с нанесением образцов через определенные промежутки времени. Такие оптимизирующие гели дают представление об оптимальной продолжительности электрофореза, проводимого с целью максимального разделения мутантного фрагмента ДНК и фрагмента ДНК дикого типа. А. Оптимизирующий гель с фрагментом ДНК, не претерпевшим заметных изменений подвижности по достижении участка с концентрацией денатурирующего вещества, соответствующей температуре плавления первого домена. Расстояние между вершиной и основанием геля измерено линейкой. Полученная информация используется для определения участка геля, соответствующего Гт первого домена плавления. Это значение в свою очередь было предварительно установлено в перпендикулярно-градиентном электрофорезе. Промежуток времени, за который фрагмент достигнет данного участка, считается минимальной продолжительностью проведения последующих электрофорезов. Обычно для получения оптимальных результатов к этому времени прибавляют еще 1—2 ч. Б. Оптимизирующий гель с фрагментом ДНК, резко изменившим подвижность при плавлении первого домена. Электрофорез в течение 12 ч (лунка 1), 10 ч (лунка 2), 8 ч (лунка 3), 6 ч (лунка 4), 4 ч (лунка 5) и 2 ч (лунка 6). Через восемь часов прохождения через гель, когда начинается процесс плавления, фрагмент замедляет движение. Оптимальное время для последующих электрофорезов этого фрагмента — 9— 10 ч. В. Оптимизирующий гель с мутантными фрагментами и фрагментами дикого типа. Если имеется известный мутантный фрагмент, то гели такого типа можно использовать для эмпирического определения оптимального времени электрофореза. Это время, за которое достигается максимальное разделение утан иого фрагмента и рагмента дикого типа.

Электрофорез гомодуплексов в градиентном геле с последующим электроблотингом геля и гибридизацией блоха с меченным зондом. [c.167]

В сотрудничестве с доктором Маниатисом и доктором Лерманом нами были разработаны два таких метода, являющиеся дополнением к анализу ПДРФ РНКазное расщепление и денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ) [15—20]. Каждый нз них позволяет идентифицировать по крайней мере 50% всех возможных замен нуклеотидов на участке ДНК Длиной до 1000 п. н. [c.124]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология