Проблемы количественного анализа аминокислот

Каковы же ближайшие перспективы Можно ли, продолжая изучение Met- и Ьеи-энкефалинов и других пептидных гормонов в том же плане, получить со временем полную и объективную количественную информацию об их структурной организации и зависимости между структурой и функцией Чтобы ответить на этот вопрос, предположим, что такой информацией мы уже располагаем, и попытаемся представить, что она могла бы дать для понимания структурно-функциональной организации энкефалинов и описания механизмов их многочисленных функций. Как можно было бы логически связать данные, например, о 10 низкоэнергетических конформациях каждого нейропептида с приблизительно таким же количеством его функций Очевидно, установить прямую связь при неизвестных пространственных структурах рецепторов не представляется возможным. Число возможных комбинаций, особенно если учесть существование нескольких рецепторов (ц, а,5) для осуществления только одной опиатной функции энкефалина, слишком велико, чтобы надеяться даже в гипотетическом идеальном случае найти искомые соотношения интуитивным путем. Многие полагают, что к достижению цели ведет косвенный путь, заключающийся в привлечении синтетических аналогов, изучении их структуры и биологической активности. В принципе подобный подход вот уже не одно столетие применяется в поиске фармацевтических препаратов. Однако такой путь в его сегодняшнем состоянии не только длителен, сложен и дорогостоящ, но, главное, он не может привести к окончательному решению проблемы. Замена аминокислот в природной последовательности, укорочение цепи или добавление новых остатков, иными словами, любая модификация химического строения природного пептида, неизбежно сопровождается изменением конформационных возможностей молекулы и одновременно затрагивает склонные к специфическому взаимодействию с рецептором остатки, что сказывается на характере внутри- и межмолекулярных взаимодействий, в том числе на устойчивости аналогов к действию протеиназ. Для учета последствий химической модификации на характер внутримолекулярных взаимодействий можно использовать теоретический конформационный анализ и методы кванто- [c.352]

Количественный анализ аминокислот методом ГХ представляет несомненный интерес. Как правило, количественное определение аминокислотного состава пептида является одним из решающих моментов анализа последовательности. Поскольку при деградации крупного белка образуется большое число фрагментов, желательно затрачивать на анализ каждого из них минимальное количество времени и вещества. Привлечение в данном случае ГХ достаточно хорошо удовлетворяет этим условиям. Многочисленные исследования по ГХ аминокислот в конечном итоге направлены на решение этой задачи. Однако к действительно эффективному количественному методу предъявляются несоизмеримо более высокие требования, чем к качественному. Если учесть к тому же трудности получения и разделения производных аминокислот, станет ясно, почему до сих пор не разработан стандартный метод их количественного определения с помощью газового хроматографа. Основные трудности связаны, как подчеркивалось в разделе о получении производных, с полифункциональными аминокислотами. Метод, игнорирующий их идентификацию, может найти лишь ограниченное применение. Количественный анализ только простых аминокислот не может удовлетворять экспериментатора [40]. Вопрос о том, все ли аминокислоты, встречающиеся в белках, можно определять ГХ с достаточной точностью, все еще остается открытым. Здссь можно только вкратце рассмотреть имеющиеся условия и возможности. Проблемы, связанные с аппаратурой, необходимой для количественной ГХ, уже обсуждались ранее (см. стр. 302). [c.335]

Возможности качественного и количественного анализа аминокислот с помощью ГХ и связанные с этим проблемы можно обсуждать только после того, как будут подробно рассмотрены известные в настоящее время методики превращения аминокислот. В результате быстрого развития этой области многие из них уже устарели. В деталях мы рассмотрим лишь несколько наиболее важных методов. Обзор соответствующих исследований, выполненных к настоящему времени, представлен в табл. 14, однако сводку данных, приведенную в ней, нельзя считать исчерпывающей. [c.311]

Применение динитрофенильных производных, введенных в практику Зангером [25] с целью идентификации и количественного определения концевых аминогрупп, позволяет получить ценные сведения о количестве открытых цепей в белке. Кроме того, такие меченые аминокислоты служат в качестве реперных точек при исследовании неполного гидролиза (1346). В этом отношении полезными являются также е -аминогруппы лизина. Путем неполного гидролиза, осуществляемого с помощью кислоты и различных типов ферментов, оказалось возможным разрывать длинные полипептидные цепи в различных точках и путем анализа установить единственно возможную конфигурацию. Этим способом Зангер и Таппи[99]и Зангер и Томпсон [100] определили порядок чередования аминокислот в двух типах цепей, входящих в состав инсулина (табл. 27). Такой подход к проблеме структуры белка был облегчен широким применением новейших микрометодов хроматографии на бумаге и силикагеле и ионофореза. Таким образом, оказывается, что одна из крупнейших проблем химии белка поддается изучению с помощью весьма простых и экономичных методов. Цепи в инсулине имеют различную длину, причем цепь с N-концевым фенилаланином (цепь В) состоит из 30 остатков, а соответствующая глициновая цепь (цепь А) — из 21 остатка. Порядок чередования аминокислот и их содержание даны в табл. 27. Можно отметить следующее. Цепь А не содержит лизина, гистидина, аргинина, треонина, фенилаланина и пролина все эти компоненты входят в состав цепи В, в которой, в свою очередь, совсем нет изолейцина. Не наблюдается ни регулярного чередования аминокислот, ни тенденции к чередованию полярных и неполярных групп. Три ароматические аминокислоты (фен.фен.тир.) расположены последовательно, и два остатка глутаминовой кислоты связаны с двумя остатками ци-стеина (глу.глу.цис.цис.). В обеих цепях содержится шесть цистеиновых остатков, четыре из которых расположены врозь, а только что упомянутые два — рядом друг с другом в молекуле нативного белка все они существуют в форме цистина, но какие из них расположены между пептидными цепями, а какие в самих пептидных цепях — неизвестно. Часть дикарбоновых кислот присутствует в виде амидов — четыре в цепи А и две в цепи В. [c.255]

Хотя рибонуклеиновые кислоты, несомненно, состоят главным образом из нуклеотидов — производных аденина, гуанина, цитозина и урацила, полная расшифровка состава таких полимеров сопряжена с рядом трудностей. Возможное присутствие очень малых количеств ненуклеотидных компонентов до недавнего времени игнорировалось в значительной степени из-за удобства применения количественных расчетов по поглощению в ультрафиолетовой области. Кроме того, выбор между артефактом и подлинным компонентом не всегда легко сделать устойчивость или неустойчивость комбинации не является критерием ковалентного или нековалентного характера связывания с такими высокомолекулярными полиэлектролитами, как нуклеиновые кислоты. Теперь известно, что в некоторых рибонуклеиновых кислотах концевой аденозиновый остаток этерифицирован по 2 - или З -гидроксильной группе одной молекулой аминокислоты. (Аналогия с ацетильными производными аденозина позволяет предположить, что такие аминокислотные производные являются исключительно З -эфирами). Неоднократно отмечалось существование пептидных производных нуклеиновых кислот, и нельзя полностью пренебрегать возможностью присутствия в рибонуклеопротеидах некоторых относительно нестойких ковалентных связей между белком и нуклеиновой кислотой. Проблема минорных ненуклеотидных компонентов рибонуклеиновых кислот до некоторой степени дискуссионна и может быть разрешена соответствующим точным анализом нуклеиновой кислоты. [c.408]

ПРОБЛЕМЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА АМИНОКИСЛОТ [c.335]

Некоторые проблемы, возникающие при количественном анализе аминокислот методом газовой хроматографии. [c.80]

Разделение производных аминокислот с помощью ГХ, которое было описано в предыдущих разделах, наталкивается на ряд трудностей, объясняемых несколькими причинами. Как уже упоминалось, раствор природных аминокислот представляет собой сложную смесь соединений различной летучести и полярности. Для этой смеси характерен широкий интервал удерживаемых объемов и необходимы высокие температуры разделения. В некоторых случаях, например для метиловых эфиров ДНФ-аминокислот, ГХ-анализ удается провести только на коротких колонках с малым количеством жидкой фазы. С другой стороны, наиболее летучие простые аминокислоты представляют собой близкие по структуре (в некоторых случаях изомерные) соединения, и для их разделения необходимы колонки с высокой избирательностью. Положение может еще более осложниться из-за того, что некоторые О-замещен-ные оксиаминокислоты выходят в тех же интервалах удерживаемых объемов и их пики могут накладываться на пики вышеупомянутых аминокислот. Этим проблемам уделяется особое внимание в работе [19], где показано, что, несмотря на использование более 80 различных жидких фаз, так и не удалось количественно разделить н-амиловые эфиры следующих ТФА-аминокислот Ала, Вал, Гли, Иле, Лей, Сер, Тре. В данном случае неудачное разделение происходит главным образом из-за О-ТФА-производных Сер и Тре. Как многократно наблюдали, производные со свободной ОН-группой имеют большие удерживаемые объемы и не мешают разделению. [c.328]

Проблема составления среды, на которой может быть показана потребность в аминокислотах и в которой может быть определено количество имеющейся в чистом растворе аминокислоты, сравнительно проста. Однако нельзя быть уверенным, что такая среда позволит количественное и специфическое определение аминокислоты в белковом гидролизате или другом естественном продукте. Как указано ранее, потребность в аминокислоте может изменяться с составом основной среды. Как общее правило, поэтому, применяемая для анализа среда должна быть составлена так, чтобы прибавление испытуемого образца пе изменяло существенно ее количественный или качественный состав, за исключением концентрации исследуемого вещества. Влияние исключений из этого правила наглядно показано в данных табл. 8. [c.188]

Метод анализа аминокислот с помощью ионообменной хроматографии базируется на работах Штейна и Мура [3—5], которые систематически изучали проблемы, связанные с разделением и количественным определением наиболее распространенных аминокислот. В 1958 г. эти авторы [5] предложили автоматическую систему, позволяющую проводить полный анализ аминокислот за 24 ч. В дальнейшем эта система неоднократно модифицировалась с целью увеличения скорости и чувствительности анализа. В настоящее время предел обнаружения аминокислот составляет несколько пикомолей, а длительность анализа равна 90 мин. Следует, однако, отметить, что ни одна из современных систем не дает такого высокого разрешения, как система, предложенная Муром и др. [5] . Уменьшение разрешающей способности, которое является следствием увеличения скорости разделения, затрудняет или даже делает невозможным определение малораспространенных аминокислот. [c.37]

Приведенные выще примеры указывают на то, что титрование отдельных остатков в белке зависит от последовательности аминокислот в нем. Однако до сих пор мы имели дело лищь с короткими пептидами, обладающими относительно гибкой конформацией. Белковые же молекулы, кроме первичной, имеют вторичную и третичную структуру. Поэтому при анализе ионизационного равновесия в белках необходимо принимать во внимание электростатические взаимодействия, возникающие между всеми близко расположенными друг к другу зарядами. Попытки количественного исследования этих взаимодействий в отдельных случаях были достаточно успещными, однако в целом эта проблема до сих пор остается чрезвычайно сложной. Как будет показано ниже, все полиэлектролиты создают вокруг себя облако из противоионов, что приводит к ослаблению ионных взаимодействий. Плотность этой ионной атмосферы зависит от концентрации электролита в растворе и от геометрии близко расположенных заряженных групп полимера. В принципе в условиях высокой ионной силы данные титрования прежде всего отражают электростатические взаимодействия между близлежащими заряженными группами. Следовательно, при таком титровании мы получаем некоторую информацию о локальной вторичной и третичной структурах. Однако сами по себе данные полного потенциометрического титрования еще недостаточно информативны. [c.48]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология