Миоглобин, рентгенограмма

В результате Джон Кендрью очень скоро понял, что едва ли я помогу ему выяснить строение миоглобина. Ему не удавалось вырастить большие кристаллы миоглобина лошади, и он рассчитывал сначала, что у меня рука окажется счастливой. Но не требовалось особой проницательности, чтобы заметить, насколько неискусны мои лабораторные манипуляции. Недели через две после моего приезда в Кембридж мы отправились на местную бойню, чтобы получить сердце лошади для изготовления нового препарата миоглобина. Если бы нам повезло, то немедленное замораживание сердца бывшего скакуна воспрепятствовало бы повреждению молекул миоглобина, которое мешало кристаллизации. Однако и мои попытки кристаллизации оказались не более успешными, чем попытки Джона. Я даже почувствовал определенное облегчение если бы я добился успеха, Джон мог бы засадить меня за съемку рентгенограмм. [c.36]

Третьим белком и в то же время первым ферментом, для которого стала известна трехмерная структура, был лизоцим. Расшифровка рентгенограммы выполнена Д. Филлипсом и сотрудниками в 1965 г. с разрешением 2,0 А. Полученные результаты явились полной неожиданностью. Лизоцим в отношении вторичных структур существенно отличался от миоглобина и гемоглобина его спиральные фрагменты содержали не 75% [c.73]

Третичная и четвертичная структуры белков определяются при помощи рентгеноструктурного анализа, который впервые был проведен применительно к миоглобину и гемоглобину Дж. Кендрью и М. Перутцем в Кембридже. Значение рентгеноструктурного анализа белков трудно переоценить, так как именно этот метод дал возможность впервые получить своеобразную фотографию белковой молекулы. Для получения информативной рентгенограммы необходимо было иметь полноценный кристалл белка с включенными в него атомами тяжелых металлов, так как последние рассеивают рентгеновские лучи сильнее атомов белка и изменяют интенсивность дифрагированных лучей. Таким образом можно определить фазу дифрагированных на белковом кристалле лучей и затем электронную плотность белковой молекулы. Это впервые удалось сделать М. Перутцу в 1954 г, что явилось предпосылкой Д 1я построения приближенной модели молекулы белка, которая затем была уточнена при помощи ЭВМ. Однако первым белком, пространственная структура которого была полностью идентифицирована Дж. Кендрью, оказался миоглобин, состоящий из 153 аминокислотных остатков, образующих одну полипептидную цепь, В результате было экспериментально подтверждено предположение Л. Полинга и Р. Кори о наличии в молекуле миоглобина а-спиральных участков, а также М. Перутца и Л. Брэгга о том, что они имеют цилиндрическую форму Несколько позднее М. Перутцем была расшифрована структура гемоглобина, состоящая из 574 аминокислотных остатков и содержащая около [c.43]

Рис. 8-3. Фотоотпечаток рентгенограммы кристаллического миоглобина кашалота. По расположению и интенсивности дифракционных пятен, возникающих в результате взаимодействия рентгеновского пучка с атомами миоглобина в кристалле, бьша рассчитана точная трехмерная структура миоглобина.

Для преодоления этой трудности был разработан метод изоморфного замещения, который состоит в том, что атом или небольшая группа атомов в молекуле замещаются атомом или группой атомов тяжелого металла. Такое замещение не вызывает изменений исходной кристаллической структуры, но существенно изменяет дифракционную картину. Сопоставлением рентгенограмм до и после замещения можно определить фазовые соотношения отдельных компонент, т. е. их смещение относительно друг друга. Впервые этот метод был применен Перу.т-цем в 1953 г. для изучения гемоглобина и несколько позже Кендрью для изучения миоглобина. [c.122]

Сущность этого метода заключается во введении в строго определенные участки полипептидной цепи белка атомов тяжелых металлов (например, атомов ртути) и сравнении рентгенограмм кристаллов свободного белка и изоморфных замещенных структур. Расшифровка получаемых карт электронной плотности позволяет создать трехмерную картину молекулы белка. Поскольку молекула миоглобина не имеет сульф-гидрильных групп, которые могли бы быть использованы для получения ртутных производных, было использовано свойство миоглобина [c.139]

Первыми были изучены два близких по своей структуре белка — гемоглобин и миоглобин, которые служат в организмах переносчиками и хранителями молекулярного кислорода. Работы с влажными кристаллами гемоглобина были начаты Перутцем, но расшифровка рентгенограмм стала возможной только после использования в 1953 г. метода изоморфного замещения в применении к белковым кристаллам. В 1957 г. Кендрью [8] этим методом установил строение молекулы миоглобина кашалота с разрешением 5,5 А, что впервые позволило расшифровать пространственное расположение полипептидной цепи в глобулярной молекуле белка, хотя в первой работе не были определены конформации отдельных звеньев. В 1959 г. такую же работу закончил Перутц с взятым им более сложным объектом — гемоглобином лошади. Впоследствии молекулу миоглобина удалось проанализировать с разрешением 2 А и определить пространственное расположение всех тяжелых атомов в молекуле. Работы с гемоглобином разного происхождения продолжаются до настоящего времени [5, 10, 22], где также достигнуто разрешение 2 А. [c.97]

Выше отмечалось, что развитие рентгеноструктурного анализа белков получило необходимый импульс в 1954 г., после того как Брэгг и Перутц впервые использовали метод изоморфного замещения для расчета знаков рефлексов в рентгенограммах гемоглобина [194]. Однако не гемоглобин оказался первым белком, трехмерная структура которого стала известной. Вследствие меньшего размера, а также благодаря более счастливому случаю с нахождением изоморфных производных и их кристаллизацией таким белком стал миоглобин. Молекула миоглобина состоит из 153 аминокислотных остатков (около 2500 атомов), образующих одну полипептидную цепь. К свернутой цепи прикреплена порфириновая плоская группа гема с атомом двухвалентного железа в центре, к которому и присоединяется молекула кислорода. Рентгеноструктурное изучение молекулы миоглобина, начатое Кендрью в 1948 г., проводилось в два этапа [198, 199]. Вначале в расчет было принято небольшое число рефлексов - несколько сотен. Этого оказалось достаточно для того, чтобы построить модель молекулы с низким разрешением. Такая модель с разрешением 6,0 А была получена в 1958 г. Кендрью и соавт. [200, 201], На ней нельзя было обнаружить не только отдельные атомы, но и боковые цепи аминокислотных остатков модель отражала конфигурацию полипептидной цепи и местоположение группы гема, содержащей атом железа. Это был первый случай, когда удалось получить, по существу, фотографию молекулы белка, правда, недостаточно четкую. [c.46]

Рентгенограммы, которые Кендрью использовал для исследования структуры миоглобина из мышц кашалота (рис. 8,3), носили очень сложный характер и содержали почти 25 ООО рефлексов. Расчеты, связанные с анализом интенсивностей всех этих дифрагированных рентгеновских лучей, проводили последовательными этапами. На первом этапе, завершенном в 1957 г., трехмерная структура миоглобина была рассчитана с разрешением 0,6 нм. При такой степени разрешения, еще не достаточной для определения точных положений индивидуальных атомов, удалось выяснить, как свернута полипептидная цепь в молекуле миоглобина. Оказалось, что она уложена довольно причудливым и нерегулярным образом, так что очертания третичной структуры миоглобина напоминают свернутую колбасу (рис. 8-4). Поскольку К-групп на рисунке нет, структура молекулы вьи-лядит намного более рыхлой. [c.190]

Изучение структуры пептидов привело к расшифровке Полингом, Кори и Брэнсоном в 1950 г. структурного элемента керотина (одного из белков, входящих в состав волос). Примененный ими метод заключался в подборе молекулярной модели, которая могла бы отвечать соответствующей рентгенограмме. Эта модель —< альфа-спираль послужила Уотсону и Крику одной из основных предпосылок для расшифровки структуры дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), представляющей две спирали, идушре в противоположном направлении и закрученные одна вокруг другой. Второй из предпосылок для решения проблемы строения ДНК было чисто техническое усовершенствование, позволившее повысить качество рентгенографии. (Оказывается, расшифровка структуры ДНК может служить сюжетом увлекательной повести [83].) В 1960 г. Кендрю и сотрудники сообщили о получении трехмерной картины распределения электронной плотности в миоглобине, что позволило построить молекулярную модель этого белка. Вскоре была расшифрована структура другого белка — гемоглобина (Перутц и сотр., 1962), а в 1964 г. структура третьего белка —< лизоцима. Лизоцим —< это первый фермент, структуру которого удалось определить. [c.247]

Не удивительно, что исследование гемоглобина шло гораздо медленнее в первую очередь из-за того, Что молекула гемоглобина по размеру в четыре раза больше миоглобина. Она состоит из двух а- и двух р-цепей. В каждую цепь входит один гем и по крайней мере мере одна сульфгидрильная группа. Вследствие наличия сульфгид-рильных групп у гемоглобина есть определенное положение, которое замещается тяжелым атомом. р-Цепи замещали /г-хлормеркур-бензоатом, димеркурацетатом й бета-меркуриалом (1,4-диацет-оксиртуть-2,3-диметоксибутан). При разрешении 5,5 А Перутц и его сотрудники получили 1200 рефлексов для каждого из этих производных и для исходного соединения. По этим рентгенограммам они [c.239]

В отличие от фибриллярных белков, которые, как правило, плохо поддаются растворению, глобулярные белки сравнительно легко растворимы. Они выполняют в организме ряд функций участвуют в переносе различных веществ, служат запасными веществами, играют роль биологических катализаторов (ферменты) и т. д. Глобулярные белки могут быть выделены из растворов в кристаллическом виде. На рентгенограммах таких кристаллов наблюдается много резких дифракщшнных максимумов, которые позволяют устанавливать структуру не только повторяющейся структурной единицы, но и особенности строения всей молекулы. Чтобы полностью использовать информацию о структуре крупных молекул, даваемую такими рентгенограммами, необходимо знать значения фаз. Как было указано в гл. XIII, по плотности почернения пятна на пленке можно определить лишь амплитуду соответствующей Фурье-компоненты, пропорциональную корню квадратному из плотности почернения, но не ее фазу. В настоящее время разработан ряд методов, позволяюших решить задачу об определении фаз. В этой главе мы опишем два метода определения фаз и обсудим результаты, полученные для двух белков — миоглобина и гемоглобина. [c.259]

В случае миоглобина для приготовления изоморфных производных была применена другая процедура [135]. Миоглобин кристаллизовали в присутствии различных неорганических ионов, включающих тяжелые атомы, например Hglf". После этого получали рентгенограммы с целью убедиться, что в дифракционных картинах чистого белка и его модифицированного аналога с металлом действительно происходит изменение интенсивности некоторых отражений. На картах разностного синтеза Патерсона в независимой области проявлялся только один пик это означало, что ионы металлов присоединяются специфически к молекуле белка. [c.218]

Рис. 29. Рентгенограмма кристалла миоглобина спермы кита (по Кен-дрью, 1961).

Макромолекулы белков образуют молекулярную решетку, в которой опи уложены рядом друг с другом. На модели (рис. 38) видна упаковка молекул миоглобина в решетке. Кристаллическая решетка моноклинная, и в элементарную ячейку входят 2 макромолекулы. Сама по себе внутримолекулярная структура миоглобина чрезвычайно сложна, но способ упаковки целых макромолекул в решетке прост. Между макромолекулами столь замысловатой формы с необходимостью должны оставаться зазоры, заполняюш иеся при кристаллизации белка водным раствором. Неудивительно, что кристаллизационная вода заполняет в белковых кристаллах часто половину и даже несколько большую часть всего объема. Высушивание белкового кристалла вызывает обычно нарушение регулярности структуры. Напомним, что белковые кристаллы долгое время вообще не считали за кристаллы, так как они не давали рентгеновской дифракции. Бернал и Дороти Ходжкин показали, что ошибка была в высушивании кристаллов если снимать рентгенограмму с белкового кристалла, находящегося в маточном растворе, удается получить поразительные по детальности рентгенограммы, насчитывающие часто более 20000 независимых рефлексов. [c.96]

Следующим успехом было повышение разрешающей способности до 2 А путем анализа 9600 интерференций. Такую титаническую работу монхно было осуществить только путем значительной механизации, в особенности всех численных расчетов. Кристаллики миоглобина (нз мышц кашалота) снимались для получения так называемых диаграмм колебаний из 22 различных положений. Затем после фотометрнрования всех пятен проводилась нормировка интенсивностей всех отдельных рентгенограмм с тем, чтобы получить вполне сравнимую серию из 9600 коэффициентов. Затем вся та же измерительная работа была проделана на четырех изоморфных дериватах белка, содержащих тяжелые атомы металлов. [c.107]

В настоящее время в ряде лабораторий проводится рентгено-структурпый анализ многих белков. Инсулин, рибонуклеаза, лизоцим и цитохром С являются ближайшими объектами. Методы снятия рентгенограмм, фотометрпрования пятен и методы вычислений поддаются в значительной степени механизации и автоматизации. Можно полагать, что в ближайшие годы рентгеноструктурный анализ даст нам точное знание первичной, вторичной и третичной структуры десятков белков. Тогда эта проблема перейдет в область решенных, т. е. станет проблемой вчерашнего дня. Даже сейчас, когда только что на примерах миоглобина и гемоглобина выработан подробный путь — алгорифм измерений и расчетов — п показан их конечный итог, мы уже можем считать все три уровня строения белка в главных чертах установленными. [c.110]

Дальнейшая работа Д. Кендрью при разрешающей способности в 2 А привела к выяснению новых подробностей вторичной конфигурации полипептидной цепи миоглобина. Это представлялось чрезвычайно важным, так как могло привести исследователей к установлению закономерностей образования третичной структуры белков. Сам Кендрью сначала даже не предполагал, Что удастся идентифицировать и боковые радикалы. Но, как он сказал на V Международном конгрессе по биохимии в 1964 г., результаты превзошли все ожидания, поскольку оказалось возможным различать на рентгенограмме отдельные боковые цепи в виде оптически более плотных участков, отходящих от основной спиральной цепи. Более детальное их исследование зачастую позволяет довольно точно идентифицировать боковые цепи иногда остаются семнения в абсолютной правильности этой идентификации, но во всяком случае при установлении строения боковых цепей уже можно выбирать всего Из двух или трех возможных вариантов [23]. Такая высокая разрешающая способность позволила ученому точно идентифицировать около одной трети всех боковых радикалов, а остальные две трети — с бчень большой степенью вероятности [23]. Эти результаты говорили сами за себя — наука очень близко подошла к возможности непосредственного определения последовательности аминокислотных остатков в молекулах глобулярных белков методом лишь одного рентгшоструктурного анализа. Кендрью сообщил о сопоставимости результатов рентгеноструктурного анализа с предварительными результатами, полученными другими авторами при помощи чисто химических методов. Так было проведено сравнение последовательности аминокислотных остатков пептидов, выделенных из миоглобина. Кендрью обнаружил, что почти все полученные таким образом пептиды могут быть размещены вдоль полипептидной цепи построенной им модели, причем этот порядок размещения соответствовал порядку размещения пептидов вдоль цепи, предложенному на основании химического анализа. Несмотря на некоторые противоречия и несовпадения, можно надеяться, что увеличение разрешающей способности метода позволит однозначно решать вопрос о последовательности аминокислотных остатков с применением только рентгеноструктурного анализа. [c.152]

Для изучения пространственной конфигурации полипептидных цепей широко пользуются физическими методами исследования, особенно рентгеноструктурным анализом. Для облегчения задачи расшифровки рентгенограмм в определенные участки молекулы белка в таких случаях часто вводят такие легко распознаваемые атомы, как атомы ртути, серебра и др. На рис. 45 дана модель, изображаюп1 ая пространственную структуру молекулы белка миоглобина по данным рентгеноструктурного анализа. [c.213]

Атомы тяжелых металлов, таких, как золото, ртуть, серебро и т. д., дают на рентгенограммах рефлексы, которые легко идентифицировать. Это можно использовать при изучении структуры белков в случае, если введение в специфические участки молекул белков атомов тяжелых металлов приводит к образованию изоморфных (кристаллографически тождественных) кристаллов. Метод изоморфного замещения впервые был предложен и с успехом использован Перутцем для изучения структуры гемоглобина лошади, а вскоре применен Кендрью для исследования строения миоглобина спермы кита. При этом существенное значение имело увеличение разрешающей способности рентгеновских установок, применение автоматических дифрактометров и использование электронносчетных машин для обработки получаемой информации. [c.150]

Л. Брэгг, Дж. Кендрью и М. Перутц сформулировали важную гипотезу о родственном строении белков, представляющую собой дальнейшее развитие взглядов У. Астбери и М. Хаггинса и получившую широкое распространение в последующих структурных исследованиях белков. Они пишут "Нельзя полагать с определенностью, что полипеп-тидная цепь имеет одинаковую конформацию во всех кристаллических (т.е. глобулярных) белках или что подобная конформация реализуется в фибриллярных белках, таких, как а-кератин. Однако вполне вероятно ожидать, что гемоглобин и миоглобин содержат цепи одинакового типа, так как эти белки в некотором отношении являются родственными более того, интервалы идентичности, межцепочечные расстояния и число остатков в интервале подобны в этих двух белках соответствующим характеристикам а-кератина" [56. С. 356]. Авторы имели определенные основания для того, чтобы сделать такое важное заключение. К этому времени ими были получены рентгенограммы кристаллов гемоглобина и миоглобина с огромным числом рефлексов. Хотя их полная интерпретация еще не могла быть выполнена, тем не менее удалось сделать ряд ценных наблюдений. Оказалось, что структуры гемоглобина и миоглобина состоят из участков с заметно различающейся плотностью атомов. Участки с большей плотностью имеют цилиндрическую форму, рентгеновское рассеяние от которых, как и в а-кератине, отвечает рефлексу 5,1 А. Рассмотрев большое количество структур полипептидной цепи, как новых, так и предло- [c.20]

Однако почти немедленно после того, как я попал в Кевендишскую лабораторию, я понял, что никогда не могу стать хорошим помощником Джону. Ведь тогда уже начались наши беседы с Френсисом Криком. Возможно, что и без Френсиса миоглобин мне бы быстро наскучил. Но после разговоров с Френсисом моя судьба была решена. Мы быстро поняли, что в биологии мы намереваемся идти одинаковым путем. Центральной проблемой биологии был ген и контролируемый им метаболизм клетки. Главной задачей было понять репликацию гена и путь, которым гены контролируют синтез белков. Бьио очевидно, что приступить к решению этих проблем можно лишь после того, как станет ясной структура гена. А это означало выяснение структуры ДНК. В то время эта цель казалась генетикам недостижимой. А мы, сидя в нашей темной, холодной Кевендишской лаборатории, думали, что эту работу можно сделать, причем за несколько месяцев. Наш оптимизм был отчасти основан на успехе Лайнуса Полинга, пришедшего к выводу о существовании а-спирали, исходя, главным образом, из законов теоретической химии, так убедительно изложенных в его классической Природе химической связи . Мы знали также, что Морис Уилкинс располагал рентгенограммами кристаллоподобной ДНК. Следовательно, ДНК должна иметь упорядоченную структуру таким образом оставалось кому-то получить ответ. [c.567]

Рис. 6.5. Рентгенограмма кристаллического миоглобина кашалота. Рефлексы образуют регулярную симметричную двумерную решетку. Приведена только часть рентгенограммы. (С любезного разрешения д-ра Джона Кэндрью.)

Справочник химика 21

Химия и химическая технология