Белки изоморфные производные

При применении нескольких производных с тяжелыми атомами на основе появляющихся изменений интенсивностей можно определить фазовый угол и затем рассчитать электронные плотности. Проведение такого структурного анализа кристаллов весьма трудоемко даже тогда, когда для сложных расчетов в распоряжении исследователя имеется высокопроизводительная вычислительная техника. Так, с кристалла белка и кристаллов различных изоморфных производных того же белка должно быть получено, измерено и скорректировано множество рефлексов. За этим следует установление положения тяжелых атомов и определение фазового угла для каждого рефлекса. Затем для нескольких десятков тысяч точек должны быть рассчитаны электронные плотности, и в заключение результаты должны быть интерпретированы. [c.384]

Большие успехи в технике рентгеноструктурного анализа Б. и получепии изоморфных производных с тяжелыми атомами позволяют предполагать, что появятся модели атомной структуры молекул и других белков. [c.122]

ВЫХ, размер кристалла хотя бы в одном из направлений дол кен быть не меньше 1 мм, а это значительно превышает размеры большинства белковых кристаллов, полученных обычными методами. Во-вторых, для установления структуры белка на основе данных но дифракции рентгеновских лучей необходимо исследовать не только нативный белок, но и ряд его изоморфных производных. Такие производные могут быть получены введением в белковые- [c.105]

В методе изоморфного замещения используют два кристалла кристалл исследуемого белка и кристалл того же белка, содержащего тяжелый атом. Последний должен быть введен таким образом, чтобы не вносить никаких изменений в структуру кристалла. Для однозначного определения фаз достаточно иметь две изоморфные производные белка. Однако практически для большей точности и контроля приходится использовать несколько изоморфных производных с различными положениями тяжелых атомов в кристаллической ячейке. [c.260]

Другая проблема, также связанная с подготовкой кристаллов к съемке, возникла значительно позже, когда в принципе была решена фазовая проблема и встала задача получения кристаллов изоморфных производных. На первых же порах, после получения прекрасных дифракционных снимков глобулярных белков, требовалось решить вопрос об их расшифровке. В чем же заключалась новизна рентгеноструктурного анализа глобулярных белков по сравнению с анализом малых молекул и фибриллярных белков Суть рентгеноструктурного анализа любого монокристалла состоит в определении амплитуд всех дифрагированных лучей (отражений) и их фаз. Зная амплитуды и фазы, можно воспроизвести распределение электронной плотности элементарной кристаллической ячейки и, следовательно, найти ее геометрические параметры, а также параметры структуры образующих ее молекул. Амплитуды определяются по интенсивностям рефлексов, но найти фазы путем непосредственных измерений нельзя. В связи с этим как в кристаллографии малых молекул, так и в кристаллографии белков возникает так называемая фазовая проблема - основная проблема расшифровки любой кристаллографической структуры. В рентгеноструктурном анализе малых молекул для ее решения разработаны прямой метод, метод Паттерсона, метод проб и ошибок, метод изоморфного замещения. Со временем каждый из них приобрел целый ряд [c.40]

Чем лимитируется минимальный атомный номер тяжелых атомов, используемых для получения изоморфных производных белков в методе изоморфного замещения [c.269]

Какое минимальное число изоморфных производных белка необходимо иметь для определения знаков структурных амплитуд центросимметричных рефлексов [c.269]

В кристаллографии белков термин изоморфизм обычно применяют к производным белков с тяжелым атомом, так называемым изоморфным производным, а метод использования этих производных носит название метода изоморфных замещений. Различные тяжелые атомы, которые вводят в кристалл, не обязательно занимают одно и то же место в разных производных. [c.216]

Диаграммы Арганда можно использовать для определения фаз структурных факторов, обусловленных рассеянием от легких атомов (/ ), если известны положение и рассеивающие способности тяжелых атомов в изоморфных производных. (Описанный ниже метод является основным методом, используемым при анализе структуры белков. — Прим. ред.) Структурный фактор тяжелых атомов рассчитывают, а модули 1 , и Рц+ь I определяют экспериментально. [c.225]

После создания метода, позволившего решить в кристаллографии белков проблему фаз и преодолеть трудности получения нужных кристаллов нативного белка и его изоморфных производных, встала задача измерения интенсивностей отражений в дифракционной картине. Она также не имела аналогий, поскольку касалась измерений, несопоставимых с кристаллографией малых молекул по числу дифрагированных лучей, многие из которых малоинтенсивны. Ощутимый прогресс Б решении этой задачи наступил только в конце 1960-х годов, после создания полностью автоматизированных дифрактометров. В последующие годы сцинтилляционные счетчики, способные регистрировать отдельные кванты рентгеновского излучения, были соединены с прибором, автоматически перемещающим кристалл и детектор с одного дифрагированного луча к другому, что привело к достаточно эффективной и точной регистрации интенсивности. В последнее время усовершенствование эксперимента направлено на создание источников рентгеновского излучения повышенной яркости и монохроматичности. Однако при этом возрастает опасность радиационного разрушения образца, вполне реальная в кристаллографии белков. [c.45]

Выше отмечалось, что развитие рентгеноструктурного анализа белков получило необходимый импульс в 1954 г., после того как Брэгг и Перутц впервые использовали метод изоморфного замещения для расчета знаков рефлексов в рентгенограммах гемоглобина [194]. Однако не гемоглобин оказался первым белком, трехмерная структура которого стала известной. Вследствие меньшего размера, а также благодаря более счастливому случаю с нахождением изоморфных производных и их кристаллизацией таким белком стал миоглобин. Молекула миоглобина состоит из 153 аминокислотных остатков (около 2500 атомов), образующих одну полипептидную цепь. К свернутой цепи прикреплена порфириновая плоская группа гема с атомом двухвалентного железа в центре, к которому и присоединяется молекула кислорода. Рентгеноструктурное изучение молекулы миоглобина, начатое Кендрью в 1948 г., проводилось в два этапа [198, 199]. Вначале в расчет было принято небольшое число рефлексов - несколько сотен. Этого оказалось достаточно для того, чтобы построить модель молекулы с низким разрешением. Такая модель с разрешением 6,0 А была получена в 1958 г. Кендрью и соавт. [200, 201], На ней нельзя было обнаружить не только отдельные атомы, но и боковые цепи аминокислотных остатков модель отражала конфигурацию полипептидной цепи и местоположение группы гема, содержащей атом железа. Это был первый случай, когда удалось получить, по существу, фотографию молекулы белка, правда, недостаточно четкую. [c.46]

Решение фазовой проблемы было найдено введением в рентгеноструктурный анализ белка его изоморфных производных невалентных комплексов белка с тяжелыми атомами (Аи, РЬ, Hg, Ag, T1 и др.), присоединение которых не должно искажать пространственного строения белковой молекулы и кристаллической решетки. Тяжелые атомы обладают большой электронной плотностью и, следовательно, значительной интенсивностью томсоновского упругого рассеяния, что сказывается на структурных факторах многих рефлексов и заметно изменяет картину рентгеновской дифракции. Различие интенсивностей дифрагированных пучков кристаллами нативного белка и его производных можно использовать для определения фаз, если предварительно установить положения тяжелых атомов. Существует несколько различных способов решения этой задачи [198, 548]. [c.156]

В трактовке дифракции рентгеновских лучей кристаллами белка н его изоморфных производных предполагается, что принадлежащие атомам электроны являются свободными и в таком состоянии приводятся в вынужденные колебания с частотой со, равной частоте первичного рентгеновского излучения Амплитуда нормального, упругого рассеяния [/°(0)] зависит от брэгговского угла (0), определяющего направление в пространстве дифрагированного луча, но не зависит от длины волны (X). В общем случае это предположение некорректно, поскольку электроны в атомах не являются свободными, а взаимодействуют, особенно эффективно на внутренних К- и -орбиталях, с ядром и друг с другом. В классической теории рассеивающие атомные центры рассматриваются наборами дипольных осцилляторов, имеющих собственные частоты колебаний (0)5), которые равны частотам поглощаемого атомом электромагнитного излучения. Когда частота падающей волны значительно отличается от частот собственных колебаний электронов (о) > 0) или ш a)J), интенсивность дифрагированного луча практически полностью определяется нормальным рассеянием, и поэтому поглощением обычно пренебрегают, т.е. считают 0)5 = 0. Однако если частота рентгеновского излучения становится сопоставимой с частотами собственных колебаний электронов (со со ), возникает резонанс, изменяющий амплитуду и фазу рассеяния. Имеет место аномальное рассеяние. [c.157]

При рассмотрении табл. 2.7 надо учитывать, что в ней приведена специфическая подборка белков. Большинство из них имеет малую молекулярную массу, и их удалось выделить в кристаллической форме в виде хорошо упорядоченных кристаллов, что позволило получить дифракционные данные по нативному белку и его изоморфным производным с высоким разрешением. По всей видимости, значительная доля вторичных структур в молекуле белка способствует образованию упорядоченных кристаллов. Практически наличие спиралей и /З-слоев в белках можно установить по результатам спектроскопических исследований растворов белков. Но для того чтобы пойти дальше и выяснить, сколько в структуре спиралей, какой они длины, сколько цепей содержится в /З-слое и т.п., обычно [c.95]

Ниже мы опишем некоторые типичные этапы определения кристаллической структуры белка (рис. 13.39). Предположим, что были приготовлены и исследованы несколько изоморфных производных. Изоморфное замещение было проведено для оценки фаз всех [c.396]

Разностный фурье<интез крайне полезен при сравнении двух структур. Например, разностная фурье-карта изоморфного производного и исходного белка должна, как уже говорилось, содержать не что иное, как электронную плотность добавленных тяжелых атомов. Аналогичным образом разностный фурье-синтез применялся для определения мест присоединения субстрата или лиганда к белку. Здесь идея состоит в том, чтобы измерить дифракционные интенсивности, отвечающие белку с присоединенным к нему лигандом. Затем по этим измеренным интенсивностям и фазам, рассчитанным для чистого белка без лиганда, строится разностная фурье-карта. Результат может дать как раз электронную плотность связанного лиганда плюс некую разность электронной плотности, возникающую из-за изменений в структуре белка под действием присоединения лиганда. Естественно, такой метод эффективен лишь в том случае, когда последние разности невелики. [c.398]

Кристаллография белков использует метод изоморфного замещения, в котором кристаллы нативного белка погружают в раствор соли металла, для того чтобы позволить тяжелым атомам занять места в кристаллической структуре. Положения более легких атомов остаются практически неизменными таким образом, подобные производные с тяжелыми металлами оказьшаются изоморфными с исходной макромолекулой, т. е. они характеризуются той же пространственной группой и практически неизменными параметрами элементарной ячейки. Разница в интенсивностях 1ш Для изоморфных кристаллов целиком определяется вкладом различных тяжелых атомов, положение которых можно определить при помощи синтеза Паттерсона. Подобная информация от по меньшей мере двух дополнительных изоморфов позволяет рассчитать фазовые углы и, затем, распределения электронной плотности для кристаллов белков. [c.409]

Так как размеры белковых молекул весьма велики, то нет настолько тяжелых атомов, рассеяние на которых могло бы преобладать в картине рентгеновской дифракции. Для установления структуры белков необходимо применять метод многократного изоморфного замещения, получая кристаллы по крайней мере двух производных с тяжелыми атомами, для которых введение тяжелого атома не изменяет геометрию кристалла белка и строение самой белковой молекулы (изоморфное замещение). [c.232]

Значительные ошибки, возникающие при определении положе ния атомов и при измерениях интенсивностей для кристаллов бел ков и их производных, определяют необходимость применения метода изоморфного замещения к более чем двум производным с тяжелыми атомами. Для проведения структурного анализа белков [c.234]

Наиболее важен в этом методе подбор подходящих производных, содержащих один тяжелый атом на молекулу. Если такие производные изучаемого соединения получены, установление его пространственной структуры является лишь вопросом времени и затраты труда. Изоморфные кристаллы белка можно получить тремя методами [c.235]

Впервые анализ пространственной структуры белка методом рентгеновской кристаллографии был осуществлен Кендрью и его коллегами для миоглобина кашалота. Наиболее плодотворным подходом для изучения белков оказался метод многократного или однократного изоморфного замещения (см. предыдущий раздел). К сожалению, поиск таких производных не имеет общих рецептов для различных белков. Как указывалось выше, нет пути, позволяющего предсказать, будет ли данное производное изоморфным по отношению к исходному белку, [c.238]

Сущность этого метода заключается во введении в строго определенные участки полипептидной цепи белка атомов тяжелых металлов (например, атомов ртути) и сравнении рентгенограмм кристаллов свободного белка и изоморфных замещенных структур. Расшифровка получаемых карт электронной плотности позволяет создать трехмерную картину молекулы белка. Поскольку молекула миоглобина не имеет сульф-гидрильных групп, которые могли бы быть использованы для получения ртутных производных, было использовано свойство миоглобина [c.139]

Главным методом, с помощью которого в настоящее время определяется третичная структура белка, является рентгеноструктурный анализ кристаллических образцов. Для рентгеноструктурного анализа необходимо получение монокристаллов белков. Проблема кристаллизации часто оказывается весьма сложной и требует не только соответствующего методического арсенала, но и высокого экспериментального искусства, а порой и просто везения. Для анализа кристаллов относительно простых соединений можно пользоваться так называемыми прямыми методами. В большинстве случаев оказывается необходимо ввести в молекулу белка тяжелый атом (например, атом ртути), причем так, Зтобы пространственная структура белка суш ественно не искажалась — это известная проблема изоморфного замещения. Кристалл изоморфного производного белка и служит основным объектом исследования. [c.99]

Определяя положение и интенсивность дифракционных максимумов (для нативного белка и для соответствующего числа его изоморфных производных), можно в принципе вывести из этих данных структуру интересующего нас бе,пка. Для получения высокого разрешения требуется провести измерения на очень большом числе дифракционных максимумов. Кендрью, например, при расшифровке структуры миоглобина измерил более 10 ООО максимумов и таким путем достиг разретония около 1,5 А. Эта работа требует весьма сложных математических расчетов, для выполнения которых приходится использовать быстродействующие вычислительные машины. [c.106]

Ошибки при использовании изоморфных производных, полученных путем замены иона металла, находящегося в нативном белке, на более тяжелые элементы, могут возникать из-за изменений в структуре металл-лигандных центров при замене металла. Кристаллографические исследования карбоксипептидазы А [29, 67] карбоангидразы С [68, 69] и нуклеазы стафилококка [33] показали что более тяжелый ион металла смещен относительно металла в на тивном белке, как и следовало ожидать, исходя из различных ко ординационных свойств и ионных радиусов соответствующих ме таллов. Из-за вполне вероятного в этих условиях изменения кон фигурации боковых цепей аминокислот, являющихся лигандами отсутствие точного изоморфизма приводит к некоторой ошибке в расчете фаз. Более того, при замене металла следует ожидать, что изменится сольватация и геометрическая структура центра, связывающего металл, как, например, при замене тетраэдрического иона цинка(П) на ртуть(П). Эти изменения также могут привести к утрате точного изоморфизма. Вообще говоря, эта проблема может быть частично решена путем использования фаз, полученных для нескольких изоморфных производных. При расчете электронной плотности вблизи центра связывания металла для производного, в котором тяжелый атом замещает катион нативного белка, могут быть использованы фазы, определенные для других производных. При этом ошибки в определении стереохимии металл- [c.23]

Метод изоморфных замещений нашел успешное применение для расшифровки структур белков, и первым примером такого рода было определение структуры гемоглобина Перутцем и сотр. [134]. Изоморфное ртутное производное гемоглобина было получено путем реакции сульфгидрильных групп белка с парахлормеркурийбен-зоатом. Продукт реакции представлял собой молекулу гемоглобина с двумя специфически связанными атомами ртути, при этом размеры элементарной ячейки остались неизменными. Сравнивая дифракционные картины от обоих соединений, можно обнаружить четкие различия интенсивностей определенных отражений. Проекция Патерсона вдоль оси Ь с коэффициентами А/ позволила определить координаты атомов ртути. Так же как и в случае фталоцианина, знаки структурных амплитуд для белка были найдены путем сопоставления величин соответствующих структурных амплитуд для чистого белка и производного с металлом. После этого была рассчитана проекция электронной плотности вдоль оси Ь, на которой можно было видеть слои молекул гемоглобина. [c.217]

В случае миоглобина для приготовления изоморфных производных была применена другая процедура [135]. Миоглобин кристаллизовали в присутствии различных неорганических ионов, включающих тяжелые атомы, например Hglf". После этого получали рентгенограммы с целью убедиться, что в дифракционных картинах чистого белка и его модифицированного аналога с металлом действительно происходит изменение интенсивности некоторых отражений. На картах разностного синтеза Патерсона в независимой области проявлялся только один пик это означало, что ионы металлов присоединяются специфически к молекуле белка. [c.218]

Новые успехи применения рентгеноструктурного анализа в расшифровке строения глобулярных белков были неразрывно связаны с его дальнейшим методическим усавершенствованием. Рентгеноструктурный анализ глобулярных белков двинулся вперед семимильными шагами после того, как в 1953 г. Перутц разработал принципы получения таких производных гемоглобина, которые содержали тяжелые атомы и которые кристаллизовались изоморфно с исходным белком, но заметно различались по дифракционным картинам своих кристаллов [354]. Этот прием позволил разработать и усовершенствовать так называемый метод изоморфного замещения, который дал исследователям принципиальную возможность однозначно определять белковые структуры. В продолжение 1953—1960 гг. метод был использован для изучения многих кристаллических белков, главным образом гемоглобина, миоглобина, инсулина, рибонуклеазы и лизоцима. Наиболее трудным было получение кристаллов соответствующих изоморфных производных белков, содержащих тяжелые атомы-заместители. [c.149]

Вторым методом, предложенным Берналом для решения фазовой проблемы рентгеноструктурного анализа белков, был метод изоморфного замещения [180]. В той форме, в какой он применялся кристалло-графами-органиками, его нельзя было использовать для белков из-за трудности получения гомогеннозамещенных молекул. Дж. Бернал исходил не из валентного связывания тяжелого атома с молекулой, как это делали Дж. Робертсон и И. Вудворд [173], а из специфического невалентного взаимодействия тяжелого атома с белком, определяемого характером профиля его потенциальной поверхности. Строго говоря, речь шла не о замещении тяжелым атомом, а о его присоединении. Оказалось возможным связать тяжелый атом с поверхностью белка без нарушения его молекулярной кристаллической структуры. Это удалось сделать Брэггу и Перутцу, которые получили изоморфные производные кристаллов нативного гемоглобина путем диффузии тяжелых атомов [194]. [c.44]

Для того чтобы уравнение (13.104) было действительно полезным, необходимо, чтобы присутствие тяжелого атома в изоморфном производном приводило к таким изменениям интенсивности рассеяния, которые позволяют измерить разность между I и I I. К примеру, один атом ртути с 80 электронами даст среднее различие между I Fpl и I Грн1в 30% для белка с мол. массой 40 ООО. Этого более чем достаточно для построения разностной паттерсоновской карты. [c.385]

Определенные схемы и комбинации приемов анализа сложных структур (адекватные уровню развития вычислительной техники). Об этом, в частности, свидетельствует становление приемов структурного анализа в такой специфической области, как химия белков. Здесь широко используется паттерсоновский метод фиксации позиции тяжелых атомов, специально вводимых в белок, сравнение паттерсоновских распределений для ряда изострук-турных производных белка, выявление знаков (начальных фаз) структурных амплитуд путем статистической обработки данных о разности единичных амплитуд в изо-структурных парах (метод изоморфного замещения). На определенной стадии анализа привлекаются и априорные сведения о геометрическом строении отдельных группировок, входящих в состав белка [c.113]

Не зная фаз, мы не можем установить структуру объекта. Как пишет Перутц [1], рентгенограмма кристалла оказывается иероглифом без ключа для его расшифровки . Метод определения фаз, развитый Перутцом применительно к белкам, состоит в том, что к молекулам, образующим кристалл, присоединяют тяжелые атомы, например атомы ртути. Тяжелый атом, т. е. атом, имеющий большую силу рассеяния, вызывает заметные изменения интенсивности дифракционных пятен. По разности амплитуд в отсутствие и в присутствии тяжелого атома можно определить фазу — тяжелый атом берется за исходную точку. Применение производных белка, содержащих несколько тяжелых атомов, позволяет решить проблему фаз однозначно. Необходимым условием при этом является полное сохранение структуры белкового кристалла при введении тяжелых атомов. Иными словами, здесь мы имеем дело с методом изоморфного замещения — ртутные производные белка дают кристаллы, изоморфные кристаллу незамещенного белка (см. [2]). [c.271]

Быстрое признание нашел метод Хендриксона в синтезе селенометиониновых производных белков. В работах последних лет кристаллы таких белков часто служат для получения дифракционных картин одновременно от аномального рассеяния, используя при этом резонансные длины волн, и от нормального рассеяния, рассматривая селен как тяжелый атом. Именно такой является работа В. Рамакришнана и соавт., в которой определена с разрешением 2,5 А трехмерная структура глобулярного домена линкерного гистона Н5 [512], [8е-Ме1]-произ-водное домена синтезировано методами генной инженерии. Выращенные из него кристаллы полностью изоморфны кристаллам нативного белка. Для фазирования применены методы МАД и МИЗ. Авторы отметили, что обработка данных, вьшолненная традиционным способом в комбинации с недавно предложенной процедурой уточнения параметров тяжелых атомов, названной методом максимальной вероятности, или максимального подобия [563, 564], привела к более предпочтительным картам электронной плотности, чем способ Хендриксона и соавт., за которым закрепилось название алгебраического метода [558]. [c.162]

Рассмотренные в этой главе исследования, по-видимому, не оставляют сомнений в том, что в 1990-е годы рентгеноструктурный анализ белков, по-прежнему сохраняя высокий темп экстенсивного развития, приступил к решению принципиально новых задач, представляющих первостепенный интерес для молекулярной биологии. Основная, если не единственная, причина наметившегося качественного изменения возможностей кристаллографии макромолекул связана с использованием синхротронной радиации. Переход к новому источнику рентгеновского излучения, во-первых, ослабляет требования, предъявляемые к размерам кристаллов, что особенно важно в структурном анализе высокомолекулярных белков и их комплексов, имеющих крупные элементарные ячейки. Во-вторых, сплошной спектр синхротронной радиации и легкость выбора любой длины волны монохроматического излучения дали возможность по-новому подойти к решению фазовой проблемы и разработать метод мультидлинноволновой аномальной дифракции, требующий для фазирования одного кристаллического образца. Существенным дополнением метода МАД стал способ рекомбинантного получения в ауксотрофных клетках белков, в аминокислотных последовательностях которых все остатки метионина заменены на селенометионин. Использование [Se-Met] белков не только освобождает рентгеноструктурный анализ от длительной рутинной процедуры приготовления нескольких изоморфных белковых производных тяжелых атомов, но практически снимает саму проблему изоморфизма. [c.163]