Нуклеотиды получение

ВЫХ оснований или нуклеотидов, полученных после расщепления полимера (подробнее — см. стр. 58). С нуклеотидным составом ДНК однозначно связаны два физических свойства двухцепочечных комплексов, которые часто используются для характеристики полученных препаратов 2 . 2в Одно из них — так называемая температура плавления Гщ — это температура, при которой происходит распад двухцепочечного комплекса на одноцепочечные молекулы этот процесс легко наблюдать по изменению УФ-поглощения или оптического вращения раствора (подробнее см. в гл. 4). Другая характерная константа ДНК — плавучая плотность р — может быть определена из результатов равновесного ультрацентрифугирования Такое центрифугирование проводят обычно в растворах солей, обладающих высокой плотностью чаще всего применяют хлорид или сульфат цезия. При длительном центрифугировании устанавливается градиент плотности раствора, а ДНК собирается в узкой зоне, где существует равновесие между центробежной силой и выталкивающей силой, которая определяется разностью плотности осаждаемого вещества и применяемого солевого раствора в данной зоне. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности Сз С1 может служить не только аналитическим методом для характеристики препарата ДНК, но и полезным препаративным методом для разделения ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Подобным же образом препаративное ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы используется для разделения молекул ДНК, различающихся по скорости седиментации. [c.31]

Таблица 3.20. Экспериментально определенные значения рКц для оснований, нуклеозидов и нуклеотидов, полученные при разной ионной силе "

Рис. 2.3. Сравнение разделения нуклеотидов, полученного при использовании градиентного элюирования и без него.

Томашевский и др. [9] привели величины Rj 35 циклических нуклеотидов, нуклеозидов, пуринов, пиримидинов и нуклеотидов, полученных при элюировании растворителями на основе ацетонитрила, а именно различными смеся,ми ацетонитрила с н-бутанолом, 0,1 М раствором ацетата аммония и 28 %-ным раствором гидроксида аммония. Продолжительность элюирования составляла от 18 до 81 мин. Ватой работе даны также результаты хроматографирования на микрокристаллической целлюлозе с применением тех же растворителей. [c.117]

Для определения нуклеотидной последовательности в олигонуклеотидах их гидролизовали нуклеазами, как это будет описано далее, и затем идентифицировали нродукты гидролиза. Для анализа нуклеотидов, полученных нри гидролизе РНК рибонуклеазой Ti, наиболее пригодна панкреатическая РНК-аза, и, наоборот, если РН1 гидролизовали панкреатической РНК-азой, для анализа полученных нуклеотидов использовали рибонуклеазу Ть В обоих случаях конечные продукты гидролиза одинаковы они содержат мононуклеотиды Г, Ц и У и олигонуклеотиды с разным числом остатков А, имеющие на З -конце Г, Ц, или У. Большинство этих продуктов можно разделить с помощью электрофореза нри pH 3,5 (фиг. 3). [c.64]

Таблица I ВЕЛИЧИНЫ М для НУКЛЕОТИДОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ПРИ ГИДРОЛИЗЕ РНК РИБОНУКЛЕАЗОЙ Т, )

Хроматографическое разделение нуклеотидов. Раствор нуклеотидов, полученных в предыдущей стадии, подщелачивают аммиаком до pH 9,0 и пропускают через хроматографическую колонку (40X400 мм), содержащую 320—350 мл анионита АВ-17 в С -форме (см. примечание 6). Скорость пропускания раствора 1 млЬнин с 1 кв. см. сечения колонки. [c.95]

Четыре простых пиримидиновых р ибо нуклеотида, полученных щелочным гидролизом рибонуклеиновых [458] (уридиловой и цитидиловой) кислот, являются 2 - и З -фосфатами нуклеозидов уридина и цитидина [459а]. 5 -Фос-фаты уридина и цитидина найдены в энзиматических гидролизатах рибонуклеиновых кислот [460]. Монофосфаты этих соединений синтезированыфосфорили-рованием соответствующих нуклеозидных производных [461]. 2, 5 - и 3, 5 -Дифосфаты уридина и цитидина найдены в продуктах гидролиза рибонуклеиновых кислот змеиным ядом [462а] . Были синтезированы циклические 2, З -фос-фаты уридина и цитидина, встречающиеся в гидролизатах рибонуклеиновых кислот под действием рибонуклеазы [463]. [c.257]

Фиг. 3. Разделение методом ионофореза на бумаге четырех нуклеотидов, полученных пз дрож кевой РНК путем щелочного гидролиза [12]. Фотография снята в ультрафиолете.

Точно измеренное количество гидролизата наносят на один конец длинной полоски фильтровальной бумаги. Бумагу увлажняют цитратным буфером с pH 3,5 и подвешивают на стеклянной палочке таким образом, что концы оказываются погруженными в чашки с буферным раствором, в которые помещают электроды. Во время ионофореза бумагу охлаждают в бане с четыреххлористым углеродом [13]. После ионофореза бумагу высушивают и положение пятен устанавливают таким же образом, как описано выше для хроматограмм. Пример разделения, осуществленного этим методом, приведен на фиг. 3. Метод ионофореза был усовершенствован Эдстрёмом [14, 52, 58] настолько, что теперь стало возможным разделять на волокнах целлюлозы нуклеотиды, полученные из нуклеиновых кислот одной клетки. [c.32]

Оптическое вращение. Упорядоченные полинуклеотиды обладают относительно сильной оптической активностью. Показателем оптического вращения (в полинуклеотидах оно обычно положительно) слу/кит либо величина [а]в, либо величина [Мр и (молярное вращение в расчете на фосфат). Оптическое вращение уменьшается по мере уменьшения степени упорядоченности соответствующие смеси нуклеотидов, полученные после полного гидролиза, обнаруживают весьма незначительное вращение. Для двухцепочечпой ДНК в водном растворе [а] колеблется в пределах от --j-100 до - -150° (что [c.144]

Молекула витамина В12 состоит из двух главных частей — замещенного по многим положениям восстановленного коррииового ядра и нуклеотида, который в отличие от нуклеотидов, полученных из нуклеиновых кислот, содержит а-гликозидную связь. Трехвалентный кобальт в макроцикле образует комплекс с четырьмя атомами азота этого цикла, с атомом азота [c.237]

Смесь с соотношением компонентов 3 2 применяли также для разделения фосфатов сахаров. В табл. 24.2 приведены величины Rf нуклеотидов, полученные на DEAE- и E TEOLA-целлюлозе. [c.127]

Величины i /XlOO нуклеотидов, полученные на PEI-целлюлозе с-различными растворителями. Длина пути элюирования 10 см [62] [c.131]

Если фосфорилировать тритильное производное без защиты вторичных спиртовых групп ацетоннрованием, остаток фосфорной кислоты этерифицирует гидроксил при втором или третьем углероде, и после снятия тритилыюй группы гидрогенолизом можно получить нуклеотид, изомерный изображенному выше по положению остатка фосфорной кислоты. Положения 5 и 3 — это как раз те положения, которые остаток фосфорной кислоты занимает в природных нуклеотидах, полученных ферментативным гидролизом полинуклеотидов. [c.678]

Превращения в спиральную конформацию приводят к ярко выраженному гипохромному эффекту также и в случае нуклеиновых кислот и полинуклеотидов. Сравнительно давно было показано [504], что оптическая плотность (с пиком при 259 м 1) дезоксирибонуклеиновой кислоты на 25—37% ниже оптической плотности сметанных нуклеотидов, полученных в результате каталитического щелочного гидролиза главной полимерной цепи. Однако причина этого изменения стала очевидной лишь после того, как была установлена структура двойной спирали молекулы ДНК. В этой структуре основные хромофоры располагаются параллельно друг другу под прямыми углами, и Тиноко [505] показал, что такое расположение должно привести к наблюдаемому гипохромному эффекту. Это явление наиболее удобно изучать на синтетических полинуклеотидах, цепи которых состоят из звеньев лишь одного типа. Фельсенфельд и Рич [364] обнаружили, что смешение растворов полиадениловой]и полиуриди-ловой кислот, приводящее, как известно, к образованию биспиральной структуры, сопровождается ярко выраженным понижением максимальной оптической плотности при 259 м 1. Таким образом, спектрофотометрическое титрование является удобным методом установления стехиометрии реакции (рис. 62). Позднее было показано [360], что изменения [c.175]

Имеется единственное сообщ ение об аминокислотном строении NA вируса гриппа В [46]. Однако аминокислотная последовательность может быть предсказана на основании последовательности клонированной кДНК-копии вирусной или мессенджер-РНК [94]. Клонированная ДНК содержит 10 нуклеотидов, полученных от клеточной РНК за счет процесса переноса кэпа , который является общим для вирусов гриппа А и В [37]. [c.277]

Обратная трансляция аминокислотной последовательности Met-Phe-Asn- ys-Trp указывает на необходимость синтеза 15-звенного вырожденного олигонуклеотида со следующей первичной структурой ATGTT(T/ )AA(T/ )TG(T/ )TGG, в которой нуклеотиды в скобках отмечают места с неоднозначной последовательностью. Теоретически олигонуклеотид длиной в 14-15 нуклеотидов, полученный путем обратной трансляции последовательности из пяти аминокислотных остатков должен быть уникальным для геномов такого размера, как геном человека. Впрочем, это утверждение верно лишь в том случае, если геном представлен случайной последовательностью. На практике это не так. В любом большом геноме встречаются мультигенные семейства с близкой первичной структурой, и наблюдается гомология между многими последовательностями, которая отражает их зависимое друг от друга происхождение. Поэтому 15-звенный олигонуклеотид при исследовании генома человека скорее всего не окажется геноспецифическим. Однако извлечь специфическую геномную последовательность с помощью таких олигонуклеотидов можно при использовании их в качестве праймеров для ПЦР на матрице кДНК соответствующей клонотеки. В этом случае неспецифические олигонуклеотиды скорее всего не будут участвовать в образовании продукта ПЦР. [c.165]

Развитие генной инженерии облегчило процесс получения мутаций в конкретных участках генома и анализ последствий этих мутаций на молекулярном уровне. Совокупность методов получения конкретных мутаций на основе генно-инженерных подходов называют направленным, или сайт-специфическим мутагенезом. Прообразом направленного мутагенеза является простая инкубация клонированного гена с химическими мутагенами in vitro, которая приводит к четкой локализации возникающих мутаций в пределах этого гена. В настоящее время разработано много эффективных методов сайт-специфического мутагенеза, позволяющих сознательно производить мутационные замены конкретных нуклеотидов. Получение заранее определенных мУ таций в сегментах рекомбинантных генов, введение мутантных [c.286]

Развитие методологии рекомбинатных ДПК и молекулярного клонирования само по себе привело к созданию новых областей биологических исследований. Однако полная реализация этих новых возможностей зависела от других проводимых одновременно разработок развития методов фракционирования, которые ПОЗВОЛЯЛИ бы разделять фрагменты ДПК, лищь незначительно различающиеся по длине (рис. П. 18) создания относительно простых и быстрых процедур секвенирования ДПК длиной несколько тысяч нуклеотидов получения специфически модифицированных генов путем внесения мутаций В их клонированные копии in vitro генетической трансформации клеток, тканей и всего организма путем введения клонированных генов В соответствующие системы. [c.210]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология