Нуклеотиды, хроматографическое разделение

Подробно хроматографическое разделение нуклеотидов описано в обзоре Копа [32]. [c.26]

Таблица 7 ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ ПИРИМИДИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ,

М раствор аммиака (5 3 по объему) [6]. Зону радиоактивности вырезают и нуклеотид элюируют водой. Возврат метки после третьего хроматографического разделения составляет 10—25%. [c.327]

Разделение. На листе хроматографической бумаги проводят простым карандашом линию старта (на расстоянии 4 см от нижнего края листа), на которую наносят исследуемые растворы (суммарное количество адениловых нуклеотидов — 0,3—0,4 мкмоль). На ту же хроматограмму наносят растворы нуклеотидов- свидетелей по 0,05— [c.184]

Моно- и диэфиры фосфорной кислоты являются кислыми водорастворимыми соединениями и их кислотная природа определяет выбор хроматографических методов, используемых для их анализа. Бумажная хроматография была одним из наиболее ранних хроматографических методов, примененных для разделения нуклеотидов, и эта техника использовалась на протяжении многих лет [1]. Тонкослойная хроматография с использованием целлюлозы или силикагеля представляет собой другой метод быстрого анализа смеси нуклеотидов [2]. [c.132]

Комбинированное использование потенциометрического метода и двухволновон спектрофотометрии позволяет с высокой чувствительностью определять количественный состав многокомпонентных смесей без их разделения. Подобный анализ основан на зависимости спектров поглощения индивидуальных компонентов от pH среды и позволяет провести определение концентраций компонентов,, имеющих, например, близкие или даже идентичные спектры поглощения в нейтральной среде при обычных условиях. При этом, например при определении количественного содержания различных нуклеотидов в составе ДНК отпадает необходимость в предварительном хроматографическом разделении этих компонентов. Предварительное хрсшатографичеокое разделение вызвано тем, что спектры поглощения нуклеозидов перекрываются между собой настолько сильно, что обычные спектрофотометрические методы определения концентрации компонентов оказываются неприменимыми. [c.279]

Хроматографическое разделение нуклеотидов. Раствор нуклеотидов, полученных в предыдущей стадии, подщелачивают аммиаком до pH 9,0 и пропускают через хроматографическую колонку (40X400 мм), содержащую 320—350 мл анионита АВ-17 в С -форме (см. примечание 6). Скорость пропускания раствора 1 млЬнин с 1 кв. см. сечения колонки. [c.95]

Неионообменная порошковая целлюлоза применяется в качестве носителя при распределительной хроматографии и электрофорезе на колонках и в слоях. Целлюлоза используется для хроматографического разделения сахаров, глицеридов, спиртов, фенолов, аминов, карбоновых и аминокислот, пептидов, белков, нуклеиновых кислот, уроновых кислот, липидов, алкалоидов, антибиотиков, гормонов, ферментов, витаминов, гербицидов и инсектицидов, неорганических ионов, красителей, углеводородов и других веществ. Применяется также для электрофореза белков, пептидов, аминокислот, нуклеиновых кислот, нуклеотидов. [c.127]

Затем спиртовой раствор нуклеотидов помещают в вакуум-экоикатор, где он испаряется, а смесь нуклеотидов растворяют небольшим количеством воды и используют для электрофоретического или хроматографического разделения. [c.50]

Ионообменные смолы очень удобны для разделения сложных смесей мононуклеотидов и низших олигонуклеотидов. На НСОО -форме этих ионитов при элюировании муравьиной кислотой или раствором формиата аммония удается осуществить очень четкое препаративное разделение компонентов смеси. Кроме крутизны градиента, которую легко регулировать, для хорошего разделения требуется выполнение еще ряда условий. Во-первых, отношение высоты колонки к диаметру должно быть примерно равно 10. Во-вторых, важно, чтобы скорость потока элюента не превышала 0,6 мл-см -мин . Еще одно очевидное требование — исключение из подаваемого в колонку раствора нежелательных анионов (трихлоруксусной кислоты, или —после экстракции хлорной кислотой — иона IO4 ) с тем, чтобы не снизилась емкость колонки, а следовательно, и ее эффективность. Если элюирование ведут муравьиной кислотой, то удалять ее после хроматографического разделения следует выпариванием в мягких условиях (например, в роторном испарителе). Экспериментатору следует помнить о том, что в процессе выпаривания происходит концентрирование в образце муравьиной кислоты, поэтому выпаривание необходимо вести при пониженной температуре. Формиат аммония можно удалить возгонкой при слегка повышенной температуре (до40°С) под вакуумом (масляный насос). Нуклеотиды можно адсорбировать из соединенных фракций на активном угле, масса которого в 5—10 раз должна превышать массу нуклеотида. После [c.327]

Патаки [157] проводил хроматографическое разделение нуклеотидов на целлюлозе, очищенной следующим образом. 60 г порошка целлюлозы диспергируют в смеси м-пропанола, 25%-ного раствора аммиака и воды (6 3 1). Суспензию энергично встряхивают в течение 30 мин, отфильтровывают твердую фазу, промывают н-пропанолом и высушивают в вакууме при 60°С. [c.53]

Методические приемы определения нуклеотидной последовательности сводятся главным образом к контролируемому расщеплению РНК различными по специфичности Арментами и хроматографическому разделению продуктов гидролиза. Анализируя продукты гидролиза на различных его стадиях и применяя подходящие наборы, гидролизующих ферментов, определяют состав каждого из таких фрагментов, восстанавливаюг порядок соединения фрагментов друг с другом и в конце концов устанавливают последовательность нуклеотидов во всей цепи РНК. [c.79]

К нелетучим или слабо летучим компонентам, выделяемым из растительных и животных тканей, относят аминокислоты, другие органические кислоты и сахара. Перед проведением анализа методом ГЖХ следует увеличить давление их паров и уменьшить полярность, удаляя или заш,ищая функциональные группы путем окисления, ацетилирования, алкилирования или другими методами. После этого, проводя хроматографическое разделение в паровой фазе, можно получить о данных соединениях такую полную информацию, какую только удается собрать относительно более летучих соединений. Кроме того, усовершенствуя этот метод, можно определить состав и в меньшей степени строение некоторых продуктов конденсации, а именно белков, полисахаридов и гликозидов. До сих пор не появилось сообщений о нуклеотидах и нуклеиновых кислотах, но почти с уверенностью можно сказать, что метод ГЖХ. будет неоценимым при анализе фосфатных и сахарных компонентов, а вероятно, и азотсодержащих оснований, входящих в эти соединения. [c.528]

Ферменты, участвующие в синтезе олиго- и полисахаридов, относятся к синтетазам и включают обычно в качестве кофакторов уридиловые, реже гуаниловые нуклеотиды. При исследовании, хлорнокислых экстрактов из мицелия грибов в них обычно обнаруживается при хроматографическом разделении большое количество таких нуклеотидов, как уридиндифосфатглюкоза (УДФГ) и уридиндифосфатацетилглюкозамин (УДФАГ), — переносчиков мономеров глюкозы и ацетилглюкозамина (Крицкий, 1965 Мансурова, 1966). [c.170]

В большинстве случаев целью модифицирования является получение ХМК с одной определенной функциональной группой в поверхностном слое. Однако иногда требуется наличие в составе привитого слоя не менее двух видов функциональных групп с разным соотношением. Такие ХМК с привитыми ионообменными группами, разбавленные алкильными радикалами различной длины, оказались селективными в хроматографическом разделении соединений, отличающихся как зарядом, так и гнд J4) ) нo тью — нуклеотидов, нуклеозидов и др. и получили название мультифазы [67]. [c.115]

На полоски хроматографической бумаги шириной 4—5 см на линию старта наносят ш,елочной гидро лизат РНК (10—20 мкл) и растворы нуклеотидов- свидетелей по 0,1—0,15 мкмоль каждого. Электрофорез проводят в течение 5 ч при силе тока 0,5 мА на 1 см поперечного сечения бумаги. Для определения времени окончания электрофоретического разделения можно использовать окрашенный маркер, например 1%-ный раствор ксиленцианола, который движется быстрее самого подвижного компонента смеси. Локализацию рибомононуклеотидов проводят в ультрахемископе. Подвижность нуклеотидов от катода к аноду возрастает в ряду цитидиловая, адениловая, гуаниловая и уридиловая кислоты. Для количественного определения участки электрофореграмм, поглощающие в ультрафиолетовой области, очерчивают простым карандашом, вырезают, измельчают и элюируют нуклеотиды 4—5 мл 0,01 н. раствора НС1 в течение 4—5 ч. В элюатах определяют поглощение на спектрофотометре при длине волны, характерной для каждого нуклеотида (см. Приложение, с. 499), рассчитывают количество их в микромолях и в процентах по отношению к сумме всех нуклеотидов в щелочном гидролизате РНК. [c.181]

Разделение проводят в камере для низковольтного электрофореза (с. 89). Кюветы заполняют цитратным буфером. Вырезают полосы хроматографической бумаги шириной 4—5 см и наносят на них тканевой экстракт и стандартные растворы нуклеотидов- свидетелей в количестве, соответствующем 0,1—0,15 мкмоль каждого нуклеотида Разделение проводят в течение 4—5 ч при градиенте напряжения 15— 20 В/см и силе тока 0,5 мА на 1 см поперечного сечения бумажной полосы. Местоположение нуклеотидов идентифицируют в ультрахемископе. [c.184]

Для создания определенного pH и поддержания на необходимом уровне готовят соответствующий буферный раствор. Если это возможно, то буферный раствор подбирают таким образом, чтобы его функциональная группа была похожа на функциональную группу образца. Так, ацетатный буферный раствор приемлем для анализа карбоновых кислот, фосфатный — для люирования нуклеотидов. Большое значение имеет чистота буферного раствора, так как он не должен детектироваться выбранным детектором, что особенно важно при работе в режиме градиентного элюирования. Чистота буферного раствора зависит от фирм-производителей, и даже разные партии одной фирмы могут различаться по составу. Каждая новая партия буферного раствора тестируется двумя холостыми хроматографическими опытами перед использованием. Второй опыт показывает, существуют ли вещества, отложившиеся в колонке в процессе регенерации или в течение последних стадий предыдущего градиента. Хотя большинство разделений проводят в водных буферных растворах, иногда добавляют органический растворитель (метанол, этанол) в количестве 3-10% для повышения селективности и улучшения растворимости образца. При этом концентрация растворителя не должна быть велика, чтобы не выдать осаждения буферной соли, о чем будет свидетельствовать появление течи в системе и увеличение сопротивления в колонке. [c.38]

Выделение и идентификацию компонентов нуклеиновых кислот производят с помощью физико-химических методов. Очень важную роль в разделении сложных смесей играют хроматографические методы ( см. 15.1). Пиримидииовые и пуриновые основания, обладающие заметным поглощением около 260 нм, обычно идентифицируют с помощью УФ-спектроскопии (см. 15.3.1). Поскольку нуклеотиды имеют кислотный характер и способны находиться в ионизированном сосюя НИИ, то для идентификации их используют также электрофорез (см. 15.1). [c.444]

По хроматографическим свойствам силикаты магния близки к силикагелям (см. разд. 1). Применяют их для разделения липидов, гликозидов, ацетилиро-ванных сахаров, азотсодержащих веществ, алкалоидов, нуклеотидов, углеводородов, терпенов, стероидов, витаминов, пестицидов, канцерогенных веществ идр. Наибольшую популярность приобрел флорисил — силикат магния со сравнительно низким содержанием окиси магния. Элюотропный ряд растворителей для адсорбционной хроматографии на флорисиле дан в разд. 166. [c.29]

Хорошие результаты, по нашим данным, дает электрофорез рибонуклеотидов в 0,04 М цитратном буфере pH 3,5 без применения ССи. Используемый при этом прибор горизонтального электрофореза должен иметь расстояние между резервуарами с буферным раствором не менее 40 см. Хроматографическую бумагу натягивают на специгальную пластмассовую рамку толщиной 5 мм и подвижной стенкой или раскладывают на редко натянутые тонкие нити типа жилки. Это делается для того, чтобы в процессе разделения нуклеотиды находились во влажной камере, а хроматографическая бумага не касалась дна прибора. [c.98]

Нуклеотиды более полярны, чем соответствующие основания и нуклеозиды, поэтому из систем, применяемых для хроматографического анализа на бумаге оснований и нуклеозидов, в случае нуклеотидов применимы лишь немногие — содержащие большие концентрации солей, кислот или оснований. Повышение содержания воды приводит обычно к ухудшению разделения и повышению значений i . Повышение концентрации неполярных веществ в системах приводит обычно к ухудшению разделения и понижению значений Ну. Солевые системы хорошо делят пуриннуклеотиды (разделяя даже смесь изомерных 2 - и З -фосфатов), но не делят пиримидиннуклеотиды кислые и основные системы хорошо разделяют пиримидиннуклеотиды и плохо делят пуриновые производные. [c.326]

Хроматографические материалы для гель-хроматографии, их назначение и структура подробно описаны в гл. 6. При соответствующей степени грануляции и применении надлежащей методики их также можно использовать для приготовления тонких слоев. Полная информация о декстрановых гелях марки сефадекс суперфайн , поставляемых фирмой Pharma ia, содержится в выпущенной этой фирмой рекламной брошюре [2]. Выбранный гель оставляют набухать в жидкой среде в течение рекомендованного промежутка времени, после чего суспензию геля наносят в виде слоев толщиной 0,5 мм с помощью соответствующего приспособления. Чтобы в системе установилось равновесие, пластинки с нанесенным слоем помещают в специальную камеру (рис. 9.6). В разд. 9.2.2 кратко изложен метод приведения системы в равновесие. В работе [66] описано разделение пуриновых и пиримидиновых оснований и нуклеотидов по упрощенной методике на смеси 16 г сефадекса G-10 с 4 г силикагеля GF254 или 4 г целлюлозы. Приготовленный слой сохраняет разделяющие свойства сефадекса, но прочность его повышается, становится примерно такой же, как у слоев силикагеля или целлюлозы. [c.109]

Устранение такого несоответствия между возможностями изучения индивидуального соединения и возможностями выделения его из сложной смеси связано с развитием хроматографических методов. В первую очередь это касается трех разновидностей метода хроматографии — бумажной, тонкослойной и газо-жидкостной,— которые появились почти через полвека после первых успешных опытов Цвета [1] в 1901—1904 гг. Открытие и развитие метода бумажной хроматографии [2] создало прочную базу для анализа и разделения сложных смесей аминокислот, пептидов, липидов и нуклеотидов, что значительно расширило возможности биохимических исследований. В известной мере аналогичная техника тонкослойной хроматографии [3, 4] на закрепленных и незакрепленных с.лоях сорбентов ускорила исследования в области синтетической органической химии и в ряде прикладных областей химии и химической технологии. [c.5]

Рааэн и Краус [69] сравнили результаты разделения на хроматографических пленках PEI-целлюлозы MN-330 и на слоях PEI-целлюлозы, приготовленных в лаборатории из целлюлозы MN-300, и нашли, что разделение на последних более эффективно. На этих слоях анализировались сложные смеси нуклеозидов и нуклеотидов. В результате получены две отдельные хроматограммы. Первое разделение проводили, элюируя пробу водой в одном направлении и смесью н-бутанол—метанол—вода—гидроксид аммония (60 20 20 1). Нуклеотиды при этом [c.130]

За последние пять лет разработаны различные методы тонкослойной хроматографии для разделения и количественного определения оснований, нуклеозидов и нуклеотидов (с принципами тонкослойной хроматографии можно ознакомиться в работе Мэнголда и др. [1]). Методика в. этой области постоянно изменяется в особенности это касается разработки подходящих хроматографических методов для разделения олиго- и полинуклеотидов. В этой статье описаны методы, которыми весьма успешно пользуются в лаборатории авторов. [c.31]

Ионообменные, в том числе хроматографические, методы выделения, очистки и разделения сложных смесей органических веществ приобрели исключительно широкое распространение как в области экспериментальных исследовашга, так и в промышленной практике. Получение многих аминокислот, полипептидов, белков, нуклеотидов, нуклеиновых кислот, выделение и очистка антибиотиков, витаминов, гормонов, алкалоидов стали немыслимы без использования ионообменных процессов, часто в сочетании с гелевой хроматографией. В нодавляюш,ем большинстве случаев процесс осуш ествляется на ионитах, принадлежащих к числу синтетических нерастворимых нолиэлектролитов с различной степенью набухания. Можно без преувеличения сказать, что ионообменные процессы как метод избирательного извлечения или метод анализа применяются во всех отраслях химии и биологии. [c.3]