Центрифугирование при фракционировании клеток

Такой способ фракционирования можно сочетать с выделением пробы. Например, при исследовании липидных фракций одноклеточных организмов первой стадией является деструкция клетки, обычно выполняемая под давлением или с помощью ультразвука. В любом случае разрушаемые клетки помещают в метанольный или водный раствор. Раствор сильно подщелачивают (10%-ный раствор гидроксида натрия) и оставляют на ночь. На этой стадии большинство эфирных связей (триглицериды) гидролизуются, а свободные кислоты, конечно, полностью нейтрализуются сильным основанием. Экстракция таким неполярным растворителем, как -гептан, приводит к удалению только так называемых не омыляемых липидов (стеринов), не затрагивая заметную часть основы клеточного вещества. Большие массы остатков органического вещества клетки могут создавать затруднения при экстракции, особенно после гидролиза. Поэтому перед экстракцией удобно проводить чисто механическое разделение — удалять остатки органических веществ центрифугированием. Фракция, содержащая жирные кислоты, может быть получена подкислением водной фазы с последующей второй экстракцией гептаном. [c.516]

Хотя доступные в настоящее время препараты ДНК бактерий, животных и растений, несомненно, представляют собой многокомпонентные смеси, эффективного их фракционирования с помощью существующих методов добиться не удается. В отдельных случаях, однако, удается получить данные, указывающие на присутствие в суммарном препарате ДНК полинуклеотидов, отличающихся по своим свойствам от основной массы ДНК клеточного ядра и являющихся, таким образом, особыми разновидностями ДНК. Так, из препаратов ДНК бактерий при фракционировании с помощью противоточного распределения, центрифугирования в градиенте сахарозы, хроматографии на фосфате кальция или колонках с МАК получены фракции, свойства которых соответствуют свойствам одноцепочечной ДНК (см., например, предполагается, что такая ДНК является промежуточным продуктом при воспроизведении ДНК в клетке. [c.34]

Для получения гранул в виде осадка, который можно подвергнуть анализу, производят фракционированное центрифугирование этих экстрактов, прибавив к ним предварительно раствор солей или сахарозы соответствующей концентрации и удельного веса. В результате непродолжительного центрифугирования при небольших скоростях из экстрактов удаляются оставшиеся целыми клетки, клеточные ядра и большие гранулы, называемые митохондриями. Дальнейшее центрифугирование при больших скоростях приводит к осаждению субмикроскопических гранул, называемых микросомами [97—100]. Для разделения цитоплазматических гранул можно применить также хроматографию [101]. [c.396]

Отделение митохондрий от других компонентов клетки чаще всего проводят методом дифференциального центрифугирования с последующим фракционированием полученного материала в градиенте плотности сахарозы (см. 3.10). [c.154]

Рибосомы вьщеляют путем дифференциального центрифугирования клеточного содержимого, получаемого после гомогенизации клеток. Известно, что этим путем удается разделить клеточное содержимое на ряд фракций (см. гл. I). Рибосомы связаны главным образом с мембранами эндоплазматической сети. Поэтому при фракционировании содержимого клетки они осаждаются вместе с обломками липопротеиновой мембраны—микросомами. [c.285]

Фракционирование гомогенатов. Из гомогената можно выделить субклеточные частицы, как надмолекулярные (клеточные органеллы), так и отдельные соединения (ферменты и другие белки, нуклеиновые кислоты, метаболиты) (см. рис. 6.8). Например, с помощью дифференциального центрифугирования можно получить фракции ядер, митохондрий, микросом (микросомы — это фрагменты эндоплазматического ретикулума). Эти органеллы различаются размерами и плотностью и поэтому осаждаются при разных скоростях центрифугирования. После осаждения микросом в надосадочной жидкости остаются растворимые компоненты клетки — растворимые белки, метаболиты. Каждую из этих фракций можно разными методами фракционировать дальше, выделяя составляющие их компоненты. Из выделенных компонентов можно реконструировать биохимические [c.195]

Источником получения ДНК обычно является ви-лочковая железа (тимус) телят, т. к. в ее клетках ядра составляют больше половины объема. Для получения РНК удобнее всего использовать дрожжи. Н. к. всегда тесно связаны с белками в нуклеопротеидных структурах. Для их освобождения проводят денатурацию белков добавлением к взвеси клеток (предварительно вскрытых путем разрушения их оболочки ) р-ра фенола высокой концентрации, а также нек-рых детергентов (напр., додецилсульфата) или хлороформа. Обычно фенольная депротеинизация ведется так, что фенола дается большой избыток и после отстаивания или центрифугирования образуются два слоя внизу — фенол, насыщенный водой, сверху — вода, насыщенная фенолом. Денатурированные белки сосредоточиваются в нижнем слое и у границы раздела, Н. к.— в верхнем водном слое, откуда их осаждают спиртом. При фенольной экстракции возможно частичное фракционирование Н. к. на ДНК (растворяется преимущественно при pH9) и РНК (растворима и при рН5). Однако полностью отделить ДНК и РНК друг от друга удается только дополнительным воздействием специфическими гидролитич. ферментами ДНК-азой и РНК-азой. Эти ферменты добьхваются из поджелудочной железы рогатого скота, подвергаются тщательной очистке и кристаллизации. Действуя ДНК-азой, разрушают ДНК и получают чистую РНК. С помощью РНК-азы очищают ДНК от РНК. После ферментативной обработки полученные продукты снова подвергают фенольной депротеинизации с последующим осаждением Н. к. спиртом. [c.189]

Фракционирование клеток в солевом растворе осложняется тенденцией гранул образовывать скопления и осаждаться в виде комков, а не в виде отдельных частиц. Это нежелательное явление можно предотвратить, измельчая клетки в 0,88 М растворе сахарозы, в котором митохондрии сохраняют палочковидное строение и способность к суправитальному окрашиванию янусом зеленым В. Однако при указанной концентрации сахарозы среда становится настолько вязкой и плотной, что для осаяедения субклеточных фракций приходится использовать чрезвычайно высокие скорости центрифугирования. Поэтому в современных исследованиях в качестве среды для измельчения клеток используют 0,25 М раствор сахарозы, в котором не происходит агрегации гранул и легко выделяется фракция митохондрий. Последние при этом обладают теми я е биохимическими свойствами, что и митохондрии, получаемые в 0,88 М растворе сахарозы, хотя они уяге не окрашиваются янусом зеленым В и имеют скорее шаровидную, а не удлиненную форму. При разделении путем дифференциального центрифугирования субклеточных фракций из гомогената в 0,25 М растворе сахарозы, полученного в гомогенизаторе Поттера — Эльвейема, удаление ядер и клеточных обломков, включая [c.130]

Если бы к такому заключению пришли только на основании наличия в митохондриях всех дыхательных ферментов, то оно было бы, несомненно, убедительным, но не безоговорочным. Однако благодаря успехам техники фракционирования удалось добиться гораздо большего. Можно показать, и притом количественно, что в митохондриях дыхание продолжается и in vitro при этом потребляются О2 и фосфат и образуются СО2 и АТФ. Для этого нужно только снабжать митохондрии достаточным количеством субстрата и фосфата, а также некоторыми другими веществами, так называемыми кофакторами (например, АДФ ). Кроме того, следует учесть еще одно обстоятельство. Если митохондрии после центрифугирования поместить в чистую воду, то они испытывают осмотический шок и в результате разбухают и лопаются (подобное явление уже было описано для бактериофага см. стр. 153). Конечно, о дыхании в этом случае больше не может быть и речи. Поэтому для предотвращения шока к суспензии митохондрий обычно добавляют сахарозу в определенной концентрации эта концентрация должна как можно более точно соответствовать осмотической концентрации содержимого митохондрий. Если это соответствие соблюдается недостаточно точно (или при недостатке одного из кофакторов), также будет происходить легкое набухание митохондрий. Правда, при этом они еще сохраняют способность потреблять кислород и образовывать Oj, однако образование АТФ прекращается. Окисление и фосфорилирование, протекавшие до этого взаимосвязанно, сопряженно, теперь разъединены . Дыхание идет вхолостую , не достигая своей цели, которая состоит, как мы знаем, в образовании АТФ. Митохондрии в этом случае быстро разрушаются. Такое разобщение окисления и фосфорилирования весьма важно для понимания многих биохимических процессов правда, обсуждать их здесь означало бы слишком далеко отойти от темы. Здесь нам важно знать, что сопряженное фосфорилирование есть признак того, что митохондрии не повреждены и нормально функционируют — как в пробирке, так и в клетке. (Следует отметить, что в митохондриях, по-видимому, происходят и другие биохимические процессы помимо дыхания, например синтез аминокислот.) [c.224]

Рассмотрим вкратце белковое и нуклеиновое хозяйство клетки Е. oli. Большая часть РНК (до 80%), а последней, как мы видели, в молодой клетке содержится 10г, находится в рибосомах. В ультрацентрифуге нри 10 g в течение 100—200 мин. можно провести полное фракционирование рибосом но константам седиментации. Полезным приемом является центрифугирование из небольшого объема суспензии рибосом, наливаемой тонким слоем на подслоенный раствор сахара. В растворе создается градиент концентрации сахара начиная с 20% у дна пробирки и до 5% непосредственно под образцом, что приводит к чрезвычайной [c.456]

Процессы, характерные для целой клетки, протекают в отдельных клеточных частицах и органеллах, которые для анализа выделяют из клетки с помощью фракционирования. Этот процесс обычно состоит из двух этапов (разд. 1.10.3) сначала клетки разрушают, а затем из образовавшейся суспензии методом центрифугирования (гл. 2) выделяют нужные частицы и органеллы. Дальнейшее разделение индивидуальных компонентов клеточных частиц и органелл и изучение их свойств проводят с помощью центрифугирования (гл. 2), хроматографии (гл. 3) или электрофореза (гл. 4). Для. определения состава, механизма действия и функций клеточных компонентов пользуются сложными количественными и качественными аналитическими методами. На атомном и молекулярном уровнях применяют целый ряд спектральных методов (гл. 5) механизм действия клеточных частиц и внутриклеточные взаимодействия изучают, используя одновременно несколько аналитических методов, таких, как спектроскопия (гл. 5) и радиоизотопные методы (гл. 6), потенциометрия, полярография (гл. 7) и манометрия (гл. 8). [c.18]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология