Трипсин автолиз

В качестве второго примера использования метода пептидных карт приведем способ анализа проб после хроматографии на колонке автолизата трипсина. В трипсине имеется 14 лизиновых и 2 аргининовых остатков. В результате полного автолиза трипсина можно ожидать от И до 17 пептидов в зависимости от локализации дисульфидных связей (связывают ли они два участка цепи между двумя соседними лизиновыми остатками или замыкаются внутри одного такого участка). Пептидная карта автолизата кристаллического (продажного) трипсина приведена на рисунке. [c.236]

В последнее время в нашей лаборатории получены данные, прямо показывающие, что фрагмент белка трипсина, образованный в результате автолиза, состоит преимущественно из левых спиралей, в то время как в белковой макромолекуле в целом превалируют правовращающие спиральные структуры. Из всего сказанного яспо, что спиральные участки могут давать слагаемые разного знака и измерение степени спиральности белка по абсолютной величине оптической активности неоднозначно. [c.71]

Гидролиз трипсином проводят в слегка щелочной среде (NH4-бикарбонатный буфер, pH 8) в течение 2—3 ч при 37°. Весовое соотношение фермент/белок должно составлять примерно 1 50. Иногда трипсин добавляют двумя порциями с интервалом в 1 —1,5 ч, с тем чтобы уменьшить эффект автолиза фермента. По этой же причине растворять трипсин следует непосредственно перед его исполь. юва-иием. Вниду относительно малого количества фермента его, как правило, не удаляют из реакционной смеси, а всю ее лиофилизируют. [c.298]

Гидролиз трипсином проводят при 37° С в щелочной среде (pH 8,0— 8,6). Для гидролиза удобно пользоваться летучими буферными растворами (после высушивания гидролизаты не содержат солей), например, раствором бикарбоната аммония. Постоянство pH среды поддерживают подщелачиванием 2 н. раствором NaOH. Время гидролиза (от 2 до 12 ч) зависит от природы анализируемого белка. Иногда время гидролиза увеличивают до 24 ч. Отношение фермента к белку 1 100 или 1 50 (по весу). При длительном гидролизе во избежание автолиза фермент нередко добавляют к субстрату двумя или тремя порциями. [c.140]

Многие белки в противоположность приведенным выше примерам связывают ионы металлов либо временно, либо в течение всего времени их существования в организме. Ранее уже упоминался пример временного связывания Са + в связи с протеолитической активацией протромбина и других компонентов системы свертывания крови (см. разд. 24.2.1.2). Иной случай представляют щелочные фосфатазы и фосфокиназы, где, по-видимому, для экранирования отрицательных зарядов фосфатной группы для облегчения атаки атома фосфора нуклеофилом требуется ион двухвалентного металла типа Mg + или Zn +. Более постоянное связывание ионов металлов белками может служить для выполнения одной из указанных ниже целей. Ионы Са + предохраняют трипсин от автолиза. Конкавалин А (см. ниже) не связывает производных глюкозы до тех пор, пока не свяжет предварительно один ион Са + и один ион Мг 2+ на субъединицу. В данном случае катионы, по-видимому, осуществляют подгонку конформации молекулы, образуя центр связывания глюкозы. Ионы металлов принимают также участие в формировании активных центров ферментов. По- [c.561]

Так, при инкубации бактериальной протеазы при повышенной температуре в присутствии ионов Са + наблюдается сдвиг оптимума pH [1]. Аналогичн >1е сдвиги обнаружены для бычьего трипсина, химотрипсина, амилазы, а также щелочной протеазы из Aspergillus flavus [2]. Эти трансформации, которые служат причиной полиморфизма некоторых ферментов, происходят в незначительной степени и при обычной температуре. Кроме того, всегда имеется опасность автолиза, протеолиза или загрязнения препаратов микроорганизмами. Поэтому, как правило, всю обработку ферментных препаратов следует проводить при температуре около 4°С и по возможности быстрее. [c.7]

Иммобилизация протеолитических ферментов предотврагцает их автолиз (и также агрегацию) и позволяет проводить исследования даже в условиях, когда в случае свободных ферментов происходит быстрый автолиз. Примером является исследование термически индуцируемых конформационных переходов иммобилизованных а- и р-трипсинов при 20—75 °С [12]. [c.438]

Атомы многих металлов также стабилизируют пространственную конформацию ферментных и иных белков. Таким действием обладают катионы Са, 2п, Мп, Mg, Со, Сп, Ре + 2, иногда Ва и также трехзарядные катионы. Они обеспечивают сохранение третичной и (или) четвертичной структуры ферментов. Особенно часто встречается стабилизирующее действие иона кальция, который защищает конформацию а-амилазы, предохраняет от денатурации (и автолиза) трипсин, защищает лизоцим, бактериальные и грибные протеиназы, некоторые пептидазы. Металл, по-видимому, может стабилизировать фермент двумя путями входя в состав его активного центра (у истинных метал-лоэнзимов) или присоединяясь к различным иным участкам на поверхности белковой частицы. При стабилизации апоферментов, например ионами Са, вероятно образуются клешневидные связи между металлом и СОО-группами. [c.166]

По-видимому, в панкреатическом соке быка есть только один трипсиноген, который активируется рядом ферментов с образованием протеазы — трипсина.. Трипсин используют в зоне pH от 7 до 9, однако его нельзя хранить при высоком значении pH длительное время, так как активный фермент легко подвергается автолизу. Автолиз значительно замедляется в присутствии ионов кальция высказано иредиоложенне, что ион этого металла предотвращает ассоциацию двух различных молекулярных форм [18]. В отсутствие Са2+ фермент полностью инактивируется за 6 час при pH 7,9 и 26° в присутствии 0,001 М Са в тех же условиях теряется 1менее 5% активности. Стабилизирующее влияние Са2+ и других ионов на некоторые белки хорошо известно [19]. Максимальная стабильность наблюдается при pH 3. Трипсин устойчив к малым концентрациям мочевины, но претерпевает обратимую денатурацию в крепких ее растворах. Известен ряд природных ингибиторов трипсина [20] подобно химотрипсину, трипсин инактивируется диизопропил-фторфосфатом. [c.123]

Подобно трипсину, химотрипсин наиболее стабилен при pH 3, а его действие на белки имеет оптимум в зоне pH 7—9. В концентрированных растворах при pH 7,8 фермент претерпевает автолиз с образованием двух различных активных форм р- и ухимотрип-сина. Химотрипсин обладает более широкой специфичностью, чем трипсин он очень легко расщепляет пептидные, амидные и сложноэфирные связи, в образовании которых участвуют карбоксильные группы ароматических аминокислот — тирозина, триптофана и фенилаланина. Несколько медленнее он расщепляет связи, образованные карбоксильными группами лейцина, метионина, глутаминовой и аспарагиновой кислот. Связи ароматических аминокислот с пролином устойчивы к действию фер.мента. [c.124]

Исходным сырьем для промышленного получения гепарина является печень и легкие. Изолирование его представляет сложную, многостадийную процедуру (описанную в ряде патентов), включающую автолиз с водой и ксилолом при комнатной температуре, извлечение щелочью и сульфатом аммония (при 50—55°), удаление главной части белков после свертывания (при 70—80°) и осаждение комплекса гепарина с белком при pH 2,5. Далее удаляют примеси жиров спиртом, примеси белков — трипсином после удаления фермента гепарин осаждают ацетоном. Дальнейшая очистка достигается обработкой реактивом Ллойда, фракционированием ацетоном, обработкой хлористы1 [ кадмием и оксалатом аммония, осаждением бензидином и, наконец, получением и кристаллизацией бариевой соли [190]. В лабораторных условиях для очистки гепарина применяется фракционирование с использованием хлористого цетилпиридиния и колоночная хроматография на ионообменных смолах. [c.228]

Фракцию клеточных стенок суспендируют в 100 мл насыщенного хлороформом трис-буфера. Добавляют дезоксирибонуклеазу (0,5 мл раствора с концентрацией 1 мг/мл) и рибонуклеазу (1,0 мл раствора с концентрацией 5 мг/мл) и инкубируют суспензию при 37 °С 30 мин. Добавляют 100 мкг кристаллического трипсина и продолжают инкубацию при той же температуре еще б ч. Клеточные стенки осаждают центрифугированием и промывают, как описано выше. Осаждение и промывание повторяют до получения гомогенного слоя. Для удаления денатурированных белков добавляют трипсин. Этот фермент вызывает автолиз пептидогликана некоторых бактерий. В этом случае при центрифугировании осадка не образуется. Если это наблюдается, обработку трипсином проводить не следует. Выделение пептидогликана из большинства грамотрицательных бактерий требует большого количества клеточного материала (20—30 г) из-за низкого содержания этого полимера в бактериях и его повышенной чувствительности к автолизу. Методика получения 150 мг пептидогликана из клеток Е. oli описана Вейделем и др. [56], [c.330]

Иммобилизация трипсина на целлюлозе. 10 мл 6%-ного раствора перйодата натрия смешивают с 0,5 г целлюлозы. Перемешивают смесь в течение 3 ч, затем осадок отделяют и промывают водой. Промытый осадок помещают в 10 мл 0,1 М трисового буфера, pH 8,0, содержащего 10 мМ СаС12 для уменьшения автолиза, и добавляют фермент. Количество добавляемого трипсина зависит от его удельной активности и, как правило, это 100 мг. Смесь инкубируют при перемешивании в течение 1—3 ч. Точное время инкубации устанавливают экспериментально, определяя удельную активность нативного трипсина и активность в супер-натанте для расчета количества фермента, связавшегося с но-сителем. Пробы для измерения активности супернатанта следует отбирать в процессе иммобилизации через каждые 20—30 мин. Полученный препарат иммобилизованного фермента отделяют фильтрованием, промывают буферным раствором и насыщенным раствором мочевины для удаления не связавшегося с носителем фермента. Высушенный на фильтре препарат иммобилизованного трипсина может храниться в течение нескольких месяцев при 4°С практически без потери активности. [c.148]

Условия гидролиза. Трипсин — это сериновая протеаза, обладающая максимальной активностью в диапазоне pH 7—9. Фермент обратимо инактивируется при рН<4. С целью предотвращения автолиза трипсин растворяют в 10 мМ НС1, после чего образец можно хранить в замороженном состоянии в течение нескольких недель. Гидролиз трипсином проводят в 0,1 М аммонийбикарбонатном буфере при соотношении фермент суб-страт=1 504-100 при 37 С в течение 1—4 ч. Гидролиз можно ограничить, используя в качестве субстрата нативный белок или снижая температуру и продолжительность инкубации. Так, например, при 25 °С в течение 30 мин в тропонине С наблюдается расщепление только б из 15 связей, чувствительных к трипсину [58]. [c.148]

Фиксация ферментов на этом полимере приводит к исчезновению более 2/3 свободных аминогрупп. Конъюгат (5.1) с трипсином имел М — 150 тыс. и обладал 160 % активности исходного фермента по отношению к низкомолекулярным субстратам, но только 20 % активности по отношению к высокомолекулярным субстратам, и был устойчив к автолизу. Для конъюгата химощипсина (5.1) эти величины составляли 50 и 7 % соответ-ствет К [c.168]

Большое число работ посвящено получению и изучению конъюгатов протеолитических ферментов — трипсина и террилитина с диальдегиддекстраном [14, 59]. Были найдены условия, позволяющие полностью связывать весь введенный в реакцию с полимером-носителем трипсин, однако активность фермента при этом снижалась до 53 % от исходной по низкомолекулярному субстрату и до 26%—по высокомолекулярному (казеину) [60]. Восстановление азометиновых и альдегидных групп в конъюгате боргидридом с целью повышения стойкости к гидролизу позволило полностью сохранить ферментативную активность, в том числе фибринолитическую. Блокирование тех же групп бисульфитом или гидроксиламином приводит к отщеплению части фермента от полимера-носителя. Скорость автолиза белка в конъюгате значительно ниже, чем у исходного фермента. Конформационная стабильность конъюгата к термоинактивации также повышена. Конъюгат с соотношением фермент полимер 2 3 обладает пониженным сродством к высокомолекулярным ингибиторам сыворотки крови человека. Введение отрицательного заряда в полимер-носитель обработкой бисульфитом способствует этому [59, 61]. Декстрановый конъюгат террилитина обладал пониженными антигенностью и иммуногенностью, а ингибирующее действие антител в сыворотке крови выражено слабее, что важно для медицинского применения [62]. [c.179]

Конъюгаты декстрана, активированного 2-амино-4,6-дихлор-1,3,5-триазином с трипсином, имели достаточно высокую активность по отношению к высокомолекулярным субстратам — казеину и фибрину (28—52 7о от активности исходного фермента), их конформационная стабильность сохранялась на уровне исходного фермента, а стабильность к автолизу была повышена [71]. Причина, видимо, заключалась в том, что число связей между ферментом и полимером было относительно небольшим, а пространственно жесткий триазиновый цикл играл в этом случае роль вставки . [c.181]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология