Миграция белков в геле

Выбор знака верхнего электрода связан с тем, что белковый препарат вносят на гель сверху. При этом следует учесть как соображения устойчивости белка при кислых или щелочных значениях pH амфолитов, располагающихся по концам градиента, так и желательность максимального начального заряда белка для увеличения скорости его миграции в геле. Степень устойчивости белка к экстремальным значениям pH может диктовать и момент внесения препарата. Если белок вносят после предварительного фокусирования амфолитов, то он быстрее достигнет своего равновесного положения. Это может иметь первостепенное значение для сохранения биологической активности, если только миграция через область pH конца градиента не представляет для данного белка опасности. В противном случае белковый препарат приходится наносить на гель до начала ИЭФ, когда смесь амфолитов еще имеет среднее значение pH. [c.40]

Изоэлектрической точкой (р1) белка называют величину pH, при которой его суммарный заряд равен нулю. Изоэлектрическое фокусирование включает электрофоретическую миграцию белка в условиях градиента pH, которая продолжается до тех пор, пока белок не достигнет такой области, где pH равен р/ белка. Суммарный заряд белка становится равным нулю, и белок концентрируется в этой области в виде узкой зоны. Любое перемещение белка из-за диффузии в сторону от этой зоны ведет к восстановлению его электрического заряда и, следовательно, к электрофоретической миграции в обратном направлении. Итак, при изоэлектрическом фокусировании электрофоретический массоперенос и зональная диффузия совместно обусловливают стационарность процесса. Белки фокусируются в различных областях градиента pH, если их значения р/различны, и таким образом разделяются (рис. 3.13). Кроме того, р/ конкретных белков можно определить непосредственно путем измерения pH в зонах фокусирования. В качестве среды для изоэлектрического фокусирования применяют градиенты плотности и полиакриламидные или гранулированные гели. [c.124]

Особой формой гелЬ Электрофореза является барьерный электрофорез [1335] (рис. 24). Белковый раствор заливают в пространство 6 между двумя слоями геля ( ) и подвергают электрофорезу. При этом в результате смешивания гелей с разными величинами электроосмоса или путем введения в полиакриламидный гель дополнительных зарядов [1064] регулируют электроосмос так, чтобы он полностью компенсировал миграцию выделяемого белкового компонента. Тогда этот белок будет оставаться в пространстве 6, в то время как другие компоненты смеси переместятся сквозь гель в отсеки 5 и 7. [c.67]

Кроме очевидного удобства внесения препарата (в любой точке градиента pH), обнаружения и элюции белков, что обусловлено горизонтальным расположением и открытой поверхностью геля, подчеркнем относительную нечувствительность рассматриваемого метода к возможности выпадения в осадок некоторых белков вблизи их изоэлектрической точки. В описанной системе эти осадки будут уходить на дно слоя геля, освобождая его сечение для свободного протекания тока и миграции других белков. При извлечении сефадекса из секции осадок можно собрать вместе с гелем, перенести в колонку и в ходе элюции снова растворить, использовав для этого подходящий буфер или солевой раствор. Возможность примириться с выпадением осадков особенно ценна на ранних стадиях очистки, когда очищаемый белок может составлять лишь малую долю всей белковой смеси. Допуская выпадение в осадок балластных белков, можно значительно увеличить загрузку геля н повысить выход нужного белка. Практика показывает, что для узких диапазонов pH загрузку гранулированного геля при ИЭФ можно довести в случае одного основного белка до 2—4 мг на 1 мл объема геля, а для смеси белков — до 5—10 мг/мл. Прн объеме геля в 80 мл это составляет внушительную величину общей загрузки — до 800 мг белковой смеси. [c.66]

Фирма ВОН для своего стандартного набора белков-маркеров в интервале М 56—280 тыс. дальтон предлагает использовать гели с 7 =3,3, а в интервале 14—72 тыс.— с 7 =10 в обоих случаях С=2,6. Отметим попутно, что эффект торможения миграции биополимеров в слабосшитых гелях с С<2,6 быстро ослабляется с уменьшением С при неизменном значении Т. По-видимому, в этом случае ярко проявляется способность жесткого комплекса белок—ДДС-Ка раздвигать гибкие, слабосшитые нити акриламида. [c.59]

При связывании белка с последовательностью ДНК может произойти изгибание молекулы ДНК в результате ее взаимодействия с определенными химическими группами на поверхности белка. Подобный изгиб ДНК, вызванный белком, достаточно легко обнаружить при электрофорезе комплексов ДНК-белок в полиакриламидном геле. Скорость миграции изогнутой ДНК в геле зависит от расстояния между двумя концами чем сильнее изогнута ДНК, тем ближе располагаются друг к другу ее концы и тем медленнее движение. Если на ДНК возникают два изогнутых участка, то расстояние между двумя концами зависит от того, имеют ли изгибы одно и то же цис) или противоположное транс) направление (рис. 9-6, А). [c.133]

Хотя для коротких олигопептидов присутствие мочевины оказывается полезным, при электрофорезе белков ее не следует вводить в гель. Мочевина вносит конформационные изменения в структуру белка. Влияние этих изменений как на степень связывания ДДС-Ка, так и на характер миграции комплекса белок — ДДС-Ка в геле еще не изучено. [c.60]

В 1986 г. были идентифицированы два фактора, связывающиеся с промотором (Staudt et al 1986). С целью идентификации небольшой фрагмент ДНК. содержащий окта-бокс, инкубировали и ядерных экстрактах из различных клеток, За гем полученные продукты фракционировали в геле. Если ядерный экстракт не содержал белка, связывающегося с этой ДНК. то небольшой фрагмент ДНК быстро двигался через гель. Однако если какой-либо белок (к йст ите.1ыю присоединялся к этой ДНК. го сс миграция через гель затруднялась. Этот оныг по сдвигу подвижности (рис, 12.16) показал, что каждое ядро содержит но крайней мере один фактор, способный присоединяться к данному фрагменту ДНК. Кроме того, клегки В-ряла (пре-В-клетки. В-клетки и плазматические клетки) дополнительно содержат еще один фактор, специфически связывающийся с ДНК окта-бокса. Эти ДНК-связывающие белки были изолированы, и белок, специфический [c.152]

Число фракций, на которые разделяется исходный белок при зональном электрофорезе, можно увеличить не только с помощью специальных методов окрашивания. Простая замена буферного раствора или поддерживающей среды дает тот же эффект. Например, при электрофорезе сыворотки на бумаге в буферном растворе трис-ЭДТА получается не пять, а девять белковых фракций [1 ]. Еще лучшее разделение можно получить в поддерживающей среде, которая обладает эффектом молекулярного сита, например в крахмальном или полиакриламидном гелях. Малые размеры пор этих гелей задерживают миграцию высокомолекулярных белков, так как трение при этом увеличивается настолько, что даже большой электростатический заряд их молекул не может компенсировать замедляющего действия поддерживающей среды. Однако в других поддерживающих средах величина белковой молекулы мало влияет на скорость миграции, поскольку эффект увеличения трения обычно компенсируется ее большим электростатическим зарядом. [c.11]

КОНЦЫ пластины подведен электрическии ток противоположных знаков. Исследуемую пробу наносят на один конец геля, и заряженные молекулы под влиянием электрического поля начинают перемещаться по гелю. Пластина с гелем окружена охлаждающей рубашкой, чтобы предотвратить перегрев, который привел бы к денатурации белка. Обычно кусочек ткани или, если речь идет о дрозофиле, целую особь гомогенизируют, чтобы разрушить клетки, удаляют твердые части центрифугированием или каким-либо другим способом, а жидкую фазу, содержащую смесь растворимых белков, помещают в лунки на одном из концов геля. Значения pH геля и гомогената подбирают таким образом, чтобы он был слабощелочным по отношению к изоэлектрической точке белка в результате белок будет заряжен отрицательно и будет мигрировать к положительному полюсу прибора. Скорость миграции любого белка зависит от размеров и суммарного заряда молекулы. Если через гель [c.113]

Это — количественный метод определения концентрации антигена [Laurell, 1966]. Раствор белка-антигена заливают в лунку, вырезанную на краю пластины геля агарозы с введенной в него антисывороткой. Под действием электрического поля белок мигрирует в этом геле. В ходе миграции образуются иммунные комплексы, связывающие антиген. Миграция продолжается до полного исчерпания антигена — по расстоянию миграции можно судить о его количестве. Это расстояние доступно наблюдению [c.139]

Этот метод количественного двумерного, или, как его чаще называют, перекрестного иммунозлектрофореза является комбинацией рассмотренных выше методов [ larke, Freeman, 1967]. Сначала в первом направлении смесь белков-антигенов разделяют обычным электрофорезом в агарозе (или ПААГ). Затем следует электрофоретическая миграция разделившихся антигенов в перпендикулярном (втором) направлении. Миграция идет в геле агарозы, смешанной с полифункциональной антисывороткой против исходной смеси антигенов. Каждый белок-антиген во втором направлении мигрирует независимо от других и образует зоны преципитации, подобные ракетам Лорелла , но более широкие у основания и напоминающие обычные хроматографические пики. Эта форма пиков обусловлена тем, что миграция начинается не из резко очерченной лунки, заполненной одинаковым по всему ее объему раствором антигена, а из более или менее размытой белковой зоны, образовавшейся в результате электрофореза в первом направлении. [c.144]

Электрофоретическая подвижность и ) жесткого комплекса белок—ДДС-На оказывается связанной с молекулярной массой белка (Л1) простым соотношением и =А—В lg М, где А и В — коэффициенты, зависящие от пористости геля, температуры и других условий эксперимента. Величину и удобнее представлять в относительных единицах, выражающих отношение путей миграции белка и бромфенолового синего за время электрофореза, т. е. в знaчjeнияx введенной ранее величины / /. Такая замена отразится только на значениях коэффициентов Л и В. Нет смысла определять эти коэффициенты в каждом опыте. Одновременно с фракционированием исследуемой смеси можно провести электрофорез набора белков- марке-ров , молекулярные массы которых точно известны. Разумеется, вся предварительная обработка ДД -Na и меркаптоэтанолом должна быть строго одинаковой для исследуемого препарата и маркеров. При электрофорезе в пластине для смеси маркеров можно отвести отдельный трек. При использовании трубок маркеры лучше добавить прямо в препарат, так как нельзя гарантировать строгой даентичности условий электрофореза в двух разных трубках, д [c.57]

Горизонтальный блочный электрофорез не нашел широкого применения, несмотря на то что он не нуждается в сложной аппаратуре. Вертикальный колоночный электрофорез, особенно-в геле, используется значительно чаще. В отсутствие геля есть два способа стабилизировать жидкость в колонке они используются также при изоэлектрическом фокусировании и изотахо-форезе (см. разд. 5.3). Один из них основан на том же принципе, который используется в горизонтальных системах, — это заполнение большей части объема колонки инертным порошком,, так что миграция белка происходит в эффективном объеме между частицами. Второй способ заключается в гравитационной стабилизации жидкости с помощью градиента плотности сахарозы. Плотный раствор сахарозы помещают на дно колонки, а поверх него наслаивают раствор с равномерно убывающей плотностью, так что в верхней части колонки, куда вводят образец, концентрация сахарозы равна или почти равна нулю. Следует отметить, что сахароза в колонке лишь стабилизирует жидкость, сводя к минимуму конвекционные токи. Она лишь немного влияет на миграцию белка вследствие увеличения вязкости по мере перемещения белка вниз по колонке. Это замедляет движение белка, но вместе с тем снижает его диффузию. Обычный способ удалить белок из колонки после электрофореза — это просто дать жидкости стечь и собрать ее в виде фракций с помощью коллектора. Эту операцию нужно делать медленно, чтобы не перемешать отдельные зоны белка, движущиеся вниз по колонке. [c.220]

A. Запаздывающие полосы расположены в полиакриламидном геле на разных уровнях потому, что кодируемые кДНК белки имеют разные размеры. Поскольку подвижность комплекса ДНК-белок зависит от суммарной мол. массы, то самый короткий из связывающихся белков (кодируемый клоном 2 кДНК) замедляет миграцию фрагмента ДНК в наименьшей степени, а самый длинный из связывающихся белков (кодируемый клоном 4 кДНК)-в наибольшей. [c.413]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология