Гели, используемые в методе ГПХ крахмальные

Электрофорез, процесс разделения молекул, основанный на разной скорости перемещения их в электрическом поле, проводят самыми разными способами. Очень небольшое количество раствора, содержащего смесь белков (например, белков сыворотки крови), наносят в виде тонкой полоски на лист фильтровальной бумаги или ацетата целлюлозы. Лист насыщают буфером и пропускают через него электрический ток. Напряжения в несколько сот вольт достаточно для разделения белков сыворотки в течение 1 ч. Для ускорения процесса и снижения диффузии низкомолекулярных веществ широко используют высоковольтный электрофорез. Прикладываемое напряжение составляет в этом случае 2—3 тыс. вольт. Образец постоянно охлаждают с помощью термостатируемых пластин иногда для той же цели всю систему погружают в сосуд с керосином. Электрофоретическое разделение больших количеств материала проводится в плоских лотках, заполненных крахмальным или каким-либо другим гелем. Одним из наиболее распространенных и чувствительных методов разделения белков является электрофорез в колонке, заполненной полиакриламидным гелем. Этот метод, в настоящее время сильно усовершенствованный, позволяет проводить разделение молекул одновременно и по размеру, и по электрическому заряду его называют методом электрофоретического молекулярного сита 127, 128]. [c.164]

Электрофорез используется для выделения и разделения ферментов на конечных стадиях очистки, а также для препаративных и аналитических целей. Для препаративного выделения и очистки ферментов проводят зонный электрофорез па бумаге и в блоках или на колонках с различными наполнителями (целлюлозным порошком, крахмалом и другими), а также электрофорез в гелях — агар-агаровом, крахмальном, полиакриламидном. Электрофорез в гелях отличается от электрофореза на порошкообразных или пористых носителях. Здесь сочетаются два метода разделения ферментов — электрофоретический и метод, основанный на гель-фильтрации. Фракционирование ферментов на основе различной электрофоретической подвижности оказывается одним из самых эффективных методов. [c.201]

Некоторые методические сложности препятствуют широкому распространению электрофореза в крахмальном геле, несмотря на его весьма большую разрешающую способность. По сравнению с электрофорезом на бумаге электрофорез в крахмальном геле включает дополнительные операции, связанные с приготовлением и гидролизом крахмала, сборкой прибора, окрашиванием и количественным определением полученных фракций. Однако присущий крахмальному гелю эффект молекулярного сита увеличивает разрешающую способность данного метода по сравнению с электрофорезом на бумаге, и поэтому его используют для более тонкого анализа. [c.12]

Сравнительно новой разновидностью зонального электрофореза является электрофорез на ацетат-целлюлозной мембране [6]. Ацетат-целлюлозная мембрана, по-видимому,— очень хорошая поддерживающая среда, уже нашедшая благодаря ряду достоинств широкое применение. Выше мы отмечали, что приготовление крахмального и агарового гелей—довольно трудоемкая операция, осложняющая метод. В то же время способы предварительной обработки ацетат-целлюлозной мембраны почти так же просты, как и в случае с фильтровальной бумагой. При этом разделение белков происходит лучше и быстрее, а для анализа достаточно 5—1000 мкг белка, растворенного в объеме 0,1—10 мкл. Как белки, так и гликопротеиды очень хорошо окрашиваются на ацетат-целлюлозной мембране, поэтому она является прекрасной поддерживающей средой с точки зрения количественной оценки этих соединений. Электрофорез на ацетат-целлюлозной мембране позволяет получить больше белковых фракций сыворотки крови, чем электрофорез на бумаге, но меньше, чем электрофорез в крахмальном геле. С помощью электрофореза на ацетат-целлюлозной мембране можно определять весьма малые количества индивидуальных белков, благодаря чему он очень подходит для анализа гомогенности выделенного нативного белка. Ацетат-целлюлозные мембраны могут быть использованы также в опытах по иммунодиффузии, что является еще одним достоинством этого метода электрофореза. [c.14]

Описанные выше методы электрофореза в крахмальном геле позволяют одновременно анализировать несколько белковых растворов (например, сразу несколько сывороток), если использовать более широкую ванну для геля. Например, в ванне шириной 124 мм можно одновременно параллельно фракционировать 8—10 сывороток. [c.81]

Электрофорез в крахмальном геле был первым электрофоретическим методом, в котором для улучшения разделения была использована среда, обладающая овойствами молекулярного сита. Крахмал — это нерастворимый в воде полисахарид. В нативном состоянии он связывает некоторое количество воды и набухает, но не способен превратиться в жидкость при повышении температуры. Путем частичного кислотного гидролиза крахмал может быть переведен в форму, представляющую собой жидкий золь при температурах выше и твердый гидрогель при комнатной температуре. Оказалось, что для электрофореза вполне подходит картофельный крахмал [1199], но можно использовать также и рисовый [1037]. [c.68]

На ранних этапах исследования гемоглобинов применяли электрофорез с подвижной границей, а также электрофорез на бумаге и в блоках крахмального геля. С помощью этих методов были выявлены первые мутантные гемоглобины. Б настоящее время в качестве носителей при электрофорезе используют ацетат целлюлозы, агаровый, крахмальный и полиакриламидный гели. Кроме того, все более широкое распространение получает изоэлектрическое фокусирование. [c.320]

Несмотря на высокую разрешающую способность, электро форез в гелях со свойствами молекулярного сита не нашел ши рокого применения в повседневной клинической практике. Он более трудоемок, чем электрофорез на ацетате целлюлозы или в агарозном геле. К тому же электрофорез в крахмальном или полиакриламидном геле труднее проводить в стандартных условиях. Проблемы стандартизации условий электрофореза в полиакриламидном геле подробно обсуждаются Маурером и Алленом [841]. Разумеется, необходимо сопоставлять стоимость метода с ценностью получаемой с его помощью информации. Основная причина того, что в повседневной практике до сих пор широко используются электрофоретические методы, обладающие ограниченной разрешающей способностью, заключается в следующем пока известна физиологическая роль лишь небольшого числа белков плазмы и те фракции, которые нельзя обнаружить простыми методами, дают мало полезной информации для диагноза. Методы электрофореза с высокой разрешающей способностью имеют исключительно важное значение в исследованиях белков плазмы, и после установления природы и физиологической роли остальных белковых компонентов эти методы, несомненно, займут свое место в клинической практике. [c.333]

Отмывка несвязанного красителя из геля может занимать много времени. Процедура окрашивания должна быть достаточно длительной, чтобы краситель мог проникнуть в середину геля, после чего избыток красителя удаляют. Продолжительность окрашивания и отмывки красителя очень сильно зависит от толщины геля — поэтому в современных методах прослеживается тенденция использовать гели толщиной до 1 мм и меньше. Следует отметить, что в крахмальных гелях, которые после фик- Сации становятся непрозрачными, окраска белковых зон регистрируется только в очень тонком поверхностном слое геля, поэтому вся процедура окрашивания и отмывки излишка красителя занимает лишь несколько минут. [c.326]

Гели. Агаровые, крахмальные, полиакриламидные и другие гели следует готовить непосредственно перед использованием, а это зачастую процесс, требующий времени. Свойства гелей таковы, что и адсорбция, и электроосмос, и расширение зон в результате диффузии очень незначительны. Гель-электрофорез применяется и для препаративных целей, но гораздо более широко используется как аналитический метод и особенно ценен для разделения смесей веществ, имеющих одинаковые заряды, но слегка различающиеся массы. [c.122]

Смитис [1199] предложил использовать для определения фенотипа гаптоглобинов горизонтальный электрофорез в крахмальном геле. Электрофоретические методы этого типа до спх пор широко применяются при повседневных анализах. Вертикальный электрофорез [1200] дает более высокое разрешение, так как он лишен недостатков, присущих горизонтальному электрофорезу (см. гл. I.I0). Однако для определения фенотипов гаптоглобина вполне пригоден и горизонтальный электрофорез. Смитис [1199] рекомендует использовать в качестве разделяющего буфера смесь 30 мМ борной кислоты и 12 мМ NaOH (конечный pH после смешивания с крахмалом равен [c.342]

Одним из наиболее распространенных методов фракционирования белков (как и методов оценки гомогенности) является диск-электрофорез (от англ. dis ontinuous-прерывистый, перемежающийся) в полиакриламидном геле, при котором используют пары буферных растворов с различными значениями pH и разной степени пористости гель. Следует отметить высокую разрешающую способность гель-электрофореза. Если при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге открываются всего 6 фракций, то при электрофорезе в крахмальном геле-10, а в полиакриламидном геле-до 18 разных белковых фракций. [c.31]

Гели в качестве поддерживающей среды при электрофорезе обладают рядом важных особенностей. Главная из них та, что размеры пор геля могут быть сравнимы с размерами белковых макромолекул. В этих условиях подвижность частиц очень резко зависит от их размеров. Таким образом, вводится дополнительный фактор, влияющий на разделение. Кроме того, адсорбция во многих гелях крайне мала. Но этим причинам электрофорез в гелях обладает чрезвычайно высокой разрешающей способностью по отношению к сложным белковым смесям — значительно более высокой, чем все другие методы. Это особенно выражено в крахмальном геле, предложенном Смитисом в 1955 г., и в синтетическом полиакриламидном геле, который все чаще используют в последнее время. В этих гелях, например, удается обнаружить до 30 компонентов сыворотки крови, в то время как фронтальный электрофорез дает только 5—7. Агаровый гель хотя и обладает малой адсорбцией по отношению к белкам, дает худшее разделение, так как размер пор в нем относительно велик. Но и в агаре было замечено, что отношение подвижностей больших и малых ионов уменьшается с увеличением концентрации агара (т. е. с уменьшением размера пор). [c.95]

Смитис [145], используя новый метод электрофореза на крахмальном геле, показал, что в сыворотке, способной связывать гемоглобин, содержится не менее трех компонентов. Если для исследования использовать электрофорез на фильтровальной бумаге [146], то компоненты гаптоглобина, наблюдаемые при электрофорезе на крахмальном геле, мигрируют в виде одной полосы в области г-глобулина, как это сообщалось в работе Джейла и др. [141]. Сейчас установлено, что присутствующие в сыворотке компоненты гаптоглобина определяются генетически [145, 147—149], причем можно различить всего шесть типов гаптоглобина [150, 151]. [c.252]

Самый простой способ обеспечения стабильности электрофоретических зон заключается в том, что в среду для электрофореза вводят вещества, образующие капиллярную структуру. Ан-тиконвекционные свойства такой системы весьма высоки, если площадь поперечного сечения капилляров достаточно мала, так как в канале круглого сечения скорость потока снижается пропорционально четвертой степени радиуса. В качестве поддерживающей среды чаще всего используются фильтровальная бумага, пленки из ацетата целлюлозы, колонки или блоки целлюлозного порошка, гранулированный крахмал или гранулы поливиниловых полимеров, а также агаровый, агарозный, крахмальный или полиакриламидный гели. Зональный электрофорез в поддерживающей среде имеет ряд важных преимуществ. При его проведении можно использовать какой-либо простой и сравнительно недорогой прибор и анализировать одновременно несколько различных препаратов. Процедуры визуализации зон и выделения фракций осуществляются довольно легко. Вещества, обладающие биологической активностью, можно выявить непосредственно на электрофореграммах. Метод легко приспособить как для крупномасштабного разделения веществ, так и для микроразделения. Удается достигнуть очень высокой разрешающей силы, особенно в среде, характеризующейся одновременно антикон векционными свойствами и эффектом молекулярного сита. [c.34]

Амилазную активность после электрофореза в полиакриламидном геле иногда выявляют с помощью метода индикатор ного геля. Гели помещают на пластину крахмала, приготовлен ную из 4%-ного гидролизованного крахмала в буферном раС творе, состоящем из 0,02 М борной кислоты и 0,01 М NaOH [668]. Затем гели инкубируют при 37 °С 15—30 мин (если для разделения панкреатических ферментов используют катионную систему) или 0,5—5 мин (в случае анионной системы). После инкубации крахмальную пластинку фиксируют и обрабатывают йодной кислотой и реактивом Шиффа. [c.297]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология