Зонды с антителами

В иммуноферментном анализе используются поли- и моноклональные антитела как по отдельности, так и вместе. Относительная легкость получения поликлональных антител из антисывороток иммунизированных животных в ряде случаев дает возможность пренебречь их гетерогенностью. Однако разработка метода получения моноклональных антител — продуктов гибридных клеток — дала им огромные преимущества в иммунохимическом анализе в связи с уникальными свойствами, выгодно отличающими их от антисывороток. Использование моноклональных антител в иммуноферментном анализе дает возможность работать с практически неограниченным источником антител, однородных по молекулярным и иммунологическим свойствам. С их появлением открылись новые возможности для структурного изучения антигенов. Это связано с тем, что моноклональные антитела, продуцируемые гибридомами, связываются со специфическим участком на поверхности белковой молекулы — антигенной детерминантой и могут быть использованы в качестве селективных зондов на определенные структурные участки. [c.306]

Наряду с ферментами в гибридизационном анализе нередко применяют введение в зонд каких-либо гаптенов, например динитрофенильных остатков. В этом случае образовавшийся дуплекс можно зарегистрировать с помощью антител, специфичных к гаптену и конъюгированных с ферментом. [c.262]

Антитела Инкубация с зондом [c.44]

Вестерн-блоттинг. Метод переноса белков на нитроцеллюлозный фильтр с последующей идентификацией интересующего исследователя белка с помощью соответствующего зонда (например, антител). Вставка. Дополнительный фрагмент ДНК, который вводят в исходную молекулу методами генной инженерии. [c.51]

Локализация белков в биологических мембранах наиболее изучена в эритроцитах. Для этого используют процессы ферментативной деградации мембранных белков, проникающие и непроникающие реагенты, связывающиеся с определенными группами белков, антитела и химические зонды. [c.29]

А что известно об изменчивости, обусловленной мутациями в кодирующих последовательностях Как мы уже знаем, для НА и в меньшей степени для NA вируса гриппа характерен высокий уровень изменчивости особенно сильно она выражена в тех областях третичной структуры, где аминокислотная цепь образует петлю, выступающую из структуры. Наоборот, за долгие годы не обнаружено никаких существенных изменений в белках HN и F парамиксовирусов, о чем, в частности, свидетельствует наличие стойкого иммунитета после инфекции или вакцинации вирусами кори и паротита. Незначительные изменения, конечно же, накапливаются и могут быть выявлены с помощью чувствительных зондов, например моноклональных антител. Но таких изменений, которые помогли бы вирусу обойти иммунологический контроль со стороны хозяина, как это периодически делает вирус гриппа, у парамиксовирусов не описано. [c.478]

Для определения концентрации веществ в большинстве иммунохимических методов к анализируемому раствору, содержащему определяемое соединение и его меченый аналог, добавляют реагент в количестве, намного меньшем необходимого по уравнению (7.12). Как немеченые, так и меченые соединения взаимодействуют с реагентом практически одана-ково, поэтому отношение их концентраций будет одним и тем же в растворе и в связанном состоянии. При этом возможность применения метода во многом определяется доступностью меченого антигена и соответствующих антител. Для введения метки используют различные реагенты радионуклиды, ферменты, красящие вещества, флуоресцентные и хеми-люминесцентные зонды, ионы металлов. До последнего времени в качестве маркеров антител применяли радиоактивные изотопы этот метод назьшается радиоиммунохимическим анализом (РИА). При этом степень [c.298]

С. применяют в научных исследованиях, особенно широко в виде производных, меченных радиоактивными атомами или флуоресцентньпли метками (см. Липидные зонды), к-рые позволяют тестировать поведение С. в тканях, клетках или мембранных структурах. Гликосфинголипиды (особенно ганглиозиды) и антитела к ним используют в лечении нек-рых патологич. состояний. [c.488]

Чтобы определить, произошло ли лигирование, 5 -конец зонда X метят биотином, а З -конец зонда V — дигоксигенином, низкомолекулярным соединением, связывающимся с соответствующим антителом. После гибридизации и лигирования проводят денатурацию ДНК для высвобождения гибридизовавшегося зонда и переносят смесь в небольшую пластиковую лунку, покрытую стрептавидином. Лунку промывают, чтобы удалить весь материал, кроме связавшегося со стрептавидином биотинилированного зонда. Затем добавляют в лунку антитела к дигоксигенину, предварительно соединенные со щелочной фосфатазой. После промывания, в ходе которого происходит удаление несвязанного конъюгата, добавляют бесцветный хромогенный субстрат. Окрашивание раствора в лунке свидетельствует о связывании антитела к дигоксигенину с зондом, меченным дигоксигенином, т. е. о том, что этот зонд был лигирован с зондом, меченным биотином. Если же окрашивания не происходит, значит лигирования не было. [c.198]

Созданы и применяются в производстве высокочувствительные диагностические препараты на основе метода ИФА (иммуноферментного анализа), ДНК-зондов, внедрения полимеразной цепной реакции (ПЦР).Используются моноклональные антитела, полученные методом гибридомной технологии. Получены генетически трансформированные кролики с геном асРНК, устойчивые к вирусам лейкоза, а также трансгенные кролики с геном альфа-2 интерферона. Разработана рекомбинантная вакцина против лейкоза крупного рогатого скота на основе оспененного вектора. На культуре клеток нарабатывается антиген и производится диагностика лейкоза крупного рогатого скота. Генно-инженерные вакцины против ящура и сибирской язвы производятся в объемах, обеспечивающих потребности в них России, стран СНГ и ряда других государств мира. [c.428]

При клоиироваиш ДНК фрагмент, содержащий изучаемый ген, выявляют обычно с помощью радиоактивного ДНК-зонда или, после экспрессии гена в клетке-хозяине, - с помощью антител, обнаруживающих кодируемый этим геном белок. Затем клеткам, несущим данный фрагмент ДНК, предоставляют возможность размножаться и нарабатывать большое количество копий как самого гена, так и молекул его продукта. Для генноинженерных задач нуклеотидную последовательность такого клонированного фрагмента ДНК изменяют, присоединяют к другой последовательности ДНК, а затем снова вводят в клетки. Сочетание клонирования ДНК с генной инженерией вооружает клеточного биолога очень мощным инструментом исследования. В принципе возможно сконструировать ген, кодирующий белок с любой желательной аминокислотной последовательностью, и присоединить его к такой промоторной последовательности ДНК, которая позволит контролировать время и тип экспрессии гена Этот новый ген можно ввести либо в клетки, выращиваемые в культуре, либо в клетки зародышевого пути мыши или плодовой мушки. У трансгенных животных эффект экспрессии включенного гена можно наблюдать на многих различных клетках и тканях. [c.343]

Недавно удалось идентифицировать рецегп ор ретиноевой кислоты. Им оказался белок, гомологичный рецепторам стероидных и тиреоидных гормонов он связывается с определенными последовательностями ДНК и регулирует транскрипцию определенных генов. Была выделена и секвенирована к ДНК. кодирующая рецептор. В настоящее время для выявления рецепторов в тканях подобных зачаткам конечностей, используются как ДНК-зонды, так и соответствующие антитела. [c.106]

Вестерн-блот-анализ гибридного белка Gal.T.HA, при котором в качестве зонда использовались моноклональные антитела к большому Т-антигену, показал, что гибридный белок подвергался деградации по всей длине. Например, антитело РАЬ423 (рис. 6.3), узнающее эпитоп, расположенный в С-концевом участке большого Т-антигена, связывается только с полосой на электрофореграмме, соответствующей белку с самой большой молекулярной массой, т. е. полноразмерным гибридным белком. Антитело РАЬ204, узнающее эпитоп, занимающий участок между аминокислотами 453 и 469 [5], взаимодействует с разными полосами, которые соответствуют как полноразмерным белковым продуктам, так и полипептидам с меньшей молекулярной массой, чем -галактозидаза. [c.178]

Наличие разных моноклональных антител к одному и тому же продукту лежит в основе количественного иммунологического анализа белка методом сэндвича , когда одно антитело используется в качестве твердой фазы для связывания присутствующего в растворе антигена, а другое антитело используется в качестве меченого зонда для обнаружения иммобилизованного материала. Хотя мы работали как с зондами, меченными так и с зондами, меченными ферментативно активными конъюгатами (в последнем случае обычно к антителам присоединяли биотин и использовали конъюгат фермента с авиди-ном), здесь мы приводим описание только первой методики, поскольку в нашей практике она оказалась более удобной. Этот метод пригоден также и для выяснения следующего вопроса о том, конкурируют ли между собой антитела за взаимодействие со стерически тесно ассоциированными участками, а также для изучения белок-белковых взаимодействий. [c.197]

Зонд (проба). Молекула, используемая для выявления специфических фрагментов ДНК, РНК или белка при блот-анализе. (Например, при скрининге геномных библиотек). Зондами могут служить молекулы кДНК, синтетические олигонуклеотиды или специфические антитела. [c.51]

В антигенсвязывающем центре антител расположена сульфгид-рильная группа, модификация которой приводит к потере иммуноглобулином способности связывания с менадионом, но никак не сказывается на эффективности взаимодействия с ДНФ. Антигенсвязывающие свойства белка меняются после его частичной де-натур ации в растворе гуанидингидрохлорида и последующей рена-турации. С использованием флуоресцентных зондов было определено расстояние между подцентрами связывания менадиона и ДНФ, составившее 1,2—1,4 нм. Этот результат был подтвержден в экспериментах по сорбции IgA на носителях, содержащих связанные через ножки различной длины ДНФ и менадион. [c.30]

Авидин и стрептавидин в качестве меченых зондов. Принципиальная схша этого метода представлена на рис. 5.3. Исследуемый образец инкубировали с высокоаффинными моноклональными антителами, ковалентно связанными с полистирольными шариками диаметром 6,5 мм [19 ]. Затем в систему вводили биоти-нилированные антитела к другим эпитопам антигена. По завершении иммунологической реакции добавляли авидин, меченный ферментом, или содержащий хемилюминесцентную метку стрептавидин. В зависимости от используемого маркера измерение осуществляли спектрофотометрически или по интенсивности люминесценции. [c.68]

Надосадочную жидкость удаляют из лунок, как описано в п. 4, и добавляют в лунки по 25 мкл меченных ФИТЦ мышиных антител против иммуноглобулинов крысы, разбавленных до соответствующего разведения. Если необходимо получить информацию только по связыванию флуоресцентного зонда с жизнеспособными клетками, то к мышиным антителам, меченным ФИТЦ, добавляют иодистый пропидий до конечной концентрации 10 мкг/мл. Мы использовали меченные ФИТЦ мышиные МА против легких каппа-цепей иммуноглобулинов крыс и (или) против F -фрагмента иммуноглобулинов крыс в концентрациях 5—10 мкг/мл. Конъюгаты ФИТЦ с МА имеют отношения флуоресцеин белок в диапазоне 1—3. После добавления меченых антител содержимое лунок ресуспендируют многоканальной пипеткой, как описано в п. 4. Панель инкубируют в ледяной бане 20—25 мин. [c.183]

В заключение этой главы кратко рассмотрим уже упомянутый метод изотермической амплификации нуклеиновых кислот, осуществляемой на кольцевых ковалентно замкнутых молекулах ДНК по типу катящегося кольца (rolling ir le amplifi ation -R A) [331]. В методе линейной R A используется один праймер, комплементарный кольцевой одноцепочечной ДНК, которая может быть получена денатурацией исходных двухцепочечных молекул. Синтезировав комплементарную цепь, ДНК полимераза начинает вытеснять 5 -конец синтезированной цепи из гибрида, причем процесс продолжается непрерывно на протяжении всей реакции, во время которой фермент совершает множество оборотов вокруг амплифицируемой кольцевой матрицы. Продуктом R A является длинная одноцепочечная ДНК, в которой мономеры, комплементарные исходной кольцевой молекуле, следуют друг за другом в виде конкатемера. Поскольку в этом случае гигантская молекула ассоциирована с единственным праймером, метод R A с успехом используется для амплификации сигнала на микроматрицах [331]. При этом на двумерных и трехмерных микроматрицах имеет место возрастание сигнала в 10 ООО раз по сравнению с сигналом, получаемым от отдельного зонда, меченного флуоресцентным красителем. Ковалентное связывание 5 -концов праймеров для R A с антителами позволяет обнаруживать белки в концентрации до 0,1 пг/мл анализируемой жидкости [332, 333]. [c.250]

Следует подчеркнуть, что маркеры, экспрессируемые лимфоцитами, можно обнаружить и на клетках иных линий. Так, С044 часто выявляется на клетках эпителия. Молекулы клеточной поверхности можно выявить с помощью флуоресцирующих антител, используемых в качестве зондов (рис. 2.9). На этом подходе основан метод проточной иммунофлуоресцентной цитометрии, позволяющей сортировать и подсчитывать клетки в зависимости от их размеров и параметров флуоресценции (см. гл. 29). С помощью этого метода удается проводить детальную сортировку популяций лимфоидных клеток. [c.23]

Другим способом получения индивидуальных антител определенной специфичности служит гибридомная технология — создание иммортали-зованной (бессмертной) линии клеток, продуцирующих антитела только одной специфичности, Т. е. моноклональные (рис. 29.16). В такой культуре можно поддерживать антителообразование неопределенно долгое время. Моноклональные антитела несравнимо лучше соответствуют целям иммуноанализа, чем гетерогенные сыворотки, получаемые от иммунных животных, и поэтому нашли широкое применение в различных областях биологии в качестве высокоспецифичных зондов. [c.537]

Отсюда, при фиксированной концентрации антитела, равновесное отношение концентраций связанного и свободного антигена количественно связано с общей концентрацией лиганда. Это соотношение лежит в основе любого иммуноанализа. Таким образом, если ввести в анализируемую систему фиксированное количество меченого антигена, то можно определить и неизвестную концентрацию антигена. Неизвестную концентрацию антитела определяют при помощи меченых антител. Для введения метки в антитело или антиген можно использовать различные метящие агенты, такие, как радионуклиды, ферменты, красные кровяные клетки, флуоресцентные и хемилюминесцентные зонды или металлы. В радиоиммуноанализе (РИА) и иммуно-ферментном анализе (ИФА) метят антиген, а в иммунорадиометрическом (ИРМА) и иммуноферментометрическом (ИФМА) анализе - антитело. В большинстве методик иммунного анализа требуется порознь определять связанный и свободный меченый антиген или антитело. Поэтому эти методики довольно громоздки и длительны. [c.57]

Первый подход заключается в том, что вместо Р-нуклеотида в ДНК-зонд внедряется химически модифицированный нуклеотид, например, биотинированная duTP, аналог dTTP. Модифицированные нуклеотиды внедряются стандартным способом, например ник-трансляцией, но с меньщей скоростью. Гибридизованный ДНК-зонд с биотиновой меткой детектируют по его взаимодействию с биотин-связы-вающими белками, такими как авидин или стрептавидин, в комплексе с ферментами, например пероксидазой хрена, кислой и щелочной фосфатазой, дающими окращенные продукты, или же с помощью системы двойных антител, используя сначала антибио-тиновые антитела и затем флуоресцирующее вторичное тело. [c.75]

Смотреть страницы где упоминается термин Зонды с антителами: [c.389] [c.188] [c.205] [c.270] [c.260] [c.634] [c.258] [c.504] [c.242] [c.261] [c.139] [c.43] [c.44] [c.43] [c.44] [c.42] [c.73] [c.314] [c.315] [c.221] [c.252] [c.127] [c.287] [c.354] [c.75]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология