Спектрофотометрическое определение нуклеиновых кислот

L5. Спектрофотометрические методы. Спектрофотометрические методы определения белков имеют ряд преимуществ по сравнению с другими методами и могут быть рекомендованы во многих случаях. Они просты, быстры и не вызывают структурных разрушений в исследуемом материале. Один из наиболее ранних прочно утвердившийся метод Варбурга и Христиана [388] основан на определении соотношения величин поглощения при 280 и 260 нм и позволяет определять белок в присутствии нуклеиновых кислот. В нескольких методах, предложенных позднее, для измерений используются другие длины волн. [c.292]

Методы количественного определения нуклеиновых кислот, основанные на спектрофотометрии в ультрафиолетовой области спектра, отличаются высокой чувствительностью и простотой проведения анализа. Необходимым этапом различных методов спектрофотометрического определения нуклеиновых кислот является их экстракция из биологического материала, сопряженная с ги"рол зом полинуклеотидов. В связи с этим следует иметь в виду, что из исследуемого материала предварительно необходимо удалить свободные нуклеотиды. [c.162]

В основе модификации спектрофотометрического метода определения суммарного содержания нуклеиновых кислот, разработанной А. С. Спириным, лежит экстракция их из биологического материала горячей хлорной кислотой с последующим определением поглощения экстрактов в ультрафиолетовой области спектра при 270 и 290 нм. Автор предложил также формулу для расчета содержания нуклеиновых кислот. [c.162]

B. H e T у П с к a Я, Ю. B. П e p у a H с к и Й, B. Г. К о H a p e B, Спектрофотометрическое определение нуклеиновых кислот у высших растений по пуриновым основаниям . Биология нуклеинового обмена у растений Сб. докладов 1958, вып. АН СССР, г. Уфа, 1959, стр. 148—153. [c.233]

Широкое распространение получили спектрофотометрические методы количественного определения веществ, имеющих характерные максимумы поглощения белков (с. 83), нуклеиновых кислот (с. 162), нуклеотидов (с. 180). [c.7]

Очевидно, что исчезновение гипохромизма при переходе спираль — клубок, при денатурации, может дать количественную меру а-спиральности белка. Ввиду трудностей, с которыми сопряжены спектрофотометрические измерения в дальней ультрафиолетовой области вблизи 2000 А, этот метод в применении к белкам малоупотребителен. Напротив, он весьма прост и эффективен в случае нуклеиновых кислот при определениях степени спаривания цепей. Длинноволновые электронные полосы поглощения нуклеиновых кислот лежат вблизи 2600 А. Эти полосы, обусловливаемые лл -переходами, характеризуются дипольными моментами, лежащими в плоскостях азотистых оснований. В табл. 5.3 приведены характеристики полос поглощения в спектрах азотистых оснований 71]. [c.288]

Спирин А. С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот. — Биохимия, 1958, № 5, с. 656—662. [c.193]

Сравните колориметрические и спектрофотометрический методы определения нуклеиновых кислот. [c.326]

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД РАЗДЕЛЬНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДЕНИНА И ГУАНИНА ПРИ КОЛИЧЕСТВЕННОМ АНАЛИЗЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ У ВЫСШИХ [c.227]

В течение многих лет результаты трудоемких и весьма грубых анализов нуклеиновой кислоты, проведенных первыми исследователями, указывали, как полагали, на эквимолекулярные отношения двух пуриновых (аденин и гуанин) и двух пиримидиновых (урацил и цитозин) оснований. Позже применение хроматографии на бумаге [222] и, в меньшей степени, ионообменной техники дало быстрые и относительно точные методы количественного определения компонентов рибонуклеиновых кислот. При гидролизе нуклеиновой кислоты щелочью образуются мононуклеотиды, которые могут быть затем разделены либо как таковые, либо в виде нуклеозидов, после дефосфорилирования. Кислотный гидролиз, напротив, дает пуриновые основания и пиримидиновые мононуклеотиды. Спектрофотометрическое определение подвергнутых разделению компонентов после элюирования их с бумаги (с применением электрофореза [223] или хроматографии) или с ионообменной смолы позволяет получать молярные соотношения оснований. [c.404]

Работа 99. Спектрофотометрическое определение суммарного содержания нуклеиновых кислот [c.323]

В основе спектрофотометрического метода определения суммарного содержания нуклеиновых кислот, разработанного А.С. Спириным, лежит экстракция их из биологического материала горячей хлорной кислотой с последующим определением поглощения экстрактов в ультрафиолетовой области спектра при 270 и 290 нм. [c.323]

Во всех способах определения < р, обсуждавшихся выше, основной трудностью остается само измерение числа молекул красителя, связанных со сверхспиральной ДНК. Препараты многих сверхспиральных ДНК довольно трудно получить, а стандартные спектрофотометрические методы определения степени связывания (гл. 23) требуют больших количеств материала. Отличный от этого способ, впервые примененный Дж. Виноградом с сотрудниками, использует изменение (сдвиг) плавучей плотности ДНК при связывании ее с этидием. Плотность этидия меньше плотности нуклеиновых кислот, и к тому же он должен вытеснять противоионы Се " при своем связывании с ДНК. Самый прямой путь — это просто титровать ДНК этидием и определить ту точку, в которой открытая и замкнутая формы одной и той же ДНК имеют одинаковую плавучую плотность. Такой образ действий, однако, потребовал бы много трудоемких экспериментов. [c.402]

В настоящее время в литературе описано несколько методов спектрофотометрического определения нуклеиновых кислот в растительных тканях [1, 2, 3, 4]. Однако эти методы имеютцелый ряд существенных недостатков. [c.227]

Друрйе авторы [2, 3] предлагают проводить прямое спектрофотометрическое определение нуклеиновых кислот по сумме пуринов без хроматографического разделения этих компонентов. Под-готовк а образца для спектрофотометрирования осуществляется также по методу Мак-Дональда. Расчет суммы нуклеиновых кислот ведется по одному максимуму полосы поглощения. Испытывая этот метод, нами было установлено, что с его помощью можно по--лучить лишь приближенный результат, так как аденин и гуанин [c.228]

Методы количественного определения нуклеиновых кислот основаны на определении содержания составляющих их компонентов азотистых оснований (как правило, спектрофотометрически благодаря поглощению в ультрафиолетовой области спектра) пентоз (с помощью химических реакций, позволяющих отдельно определять рибозу и дез-оксирибозу) и фосфора нуклеиновых кислот. [c.161]

В настоящее время метод остановленной струи широко приме-ляется для решения многих задач химической кинетики установление механизмов химической реакции, определение стадий, лимитирующих протекание реакции обнаружение промежуточных комплексов, определение кинетики ферментативных реакций, установление числа и концентрации активных центров фермента, изучение быстрых конформационны5( переходов в белках и нуклеиновых кислотах. Метод требует быстрой регистрации это единственное существенное ограничение его применимости. Особое внимание при применении метода остановленной струи необходимо уделять тер-мостатированию, так как разница в температурах в кювете наблюдения и растворе смеси реагентов может привести к большим оптическим ошибкам, затрудняющим установление механизма наблюдаемой реакции. Точность определения констант скоростей данным методом примерно такая, как и при обычных спектрофотометрических измерениях кинетики химических реакций. [c.28]

Применение. В гистохймии в качестве реактива на дезоксирибозу и рибозу нуклеиновых кислот [1]. Метод дает совершенно отчетливое и различное окрашивание нуклеиновых кислот растительных тканей, однако, результаты, получаемые при исследовании тканей животных, не являются удовлетворительными [Пирс, 176]. В аналитической химии в качестве реактива на Ое, 8Ь, Мо, Зп, Та, N1), и, Т1, 2г, Введен в рациональный ассортимент органических реактивовг на неорганические ионы для определения германия (2, 3) и сурьмы [4, 5] спектрофотометрическим методом. [c.410]

Реагенты, способные реагировать со свободными аминогруппами. В качестве такого реагента в химии нуклеиновых кислот часто используется формальдегид он реагирует со свободными аминогруппами цитозина, гуанина и аденина, образуя соответствующие оксиметильные производные (или — после дегидратации — шиффовы основания). Эта реакция сопровождается изменением спектра поглощения (смещением максимума в сторону длинных волн и усилением поглощения в области максимума) поэтому ее можно прослеживать спектрофотометрически. Все основания двухцепочечной ДНК в ее нативной конформации, а также больший или меньший процент оснований в других упорядоченных полинуклеотидах защищены от этой реакции, т. е. не реагируют с формальдегидом, если соблюдаются определенные меры предосторожности (нейтральное значение pH, низкая температура, низкая концентрация), сводящие к минимуму конформационные изменения, которые могут происходить даже в условиях, когда новые ковалентные связи не образуются. [c.145]

Колориметрия и УФ-спектрофотометрия применимы в случае любых РНК. Все РНК имеют одинаковый коэффициент экстинкции при колориметрическом определении. В присутствии белков, полисахаридов и многих других веществ, поглощающих УФ-свет (в том числе фенола, который часто применяется при выделении нуклеиновых кислот), точность УФ-спектрофотометрическо-го анализа снижается. Отклонения от нормального спектра свидетельствуют о загрязнении белком, углеводом или другими соединениями. [c.340]

Для определения концентрации ДНК в растворе широко используются 3 метода. Наиболее простым и точным является спектрофотометрический метод, однако он обладает сравнительно малой чувствительностью. Однако, если содержание сумарной фракции ДНК невелико, концентрацию ее можно определить по интенсивности флуоресценции ее комплексов с бромистым этидием или бисбензимидом (Н33258), либо методом гибридизации со специфичным олигонуклеотидом. В таблице 6 представлены данные по чувствительности и специфичности спектрофотометрического и флуориметрическо-го методов анализа нуклеиновых кислот. [c.178]

Существенный фактор при выполнении ДНК из растительных клеток — эффективное разрушение клеточных стенок. К сожалению, многие методы, используемые для этого, приводят к фрагментации ДНК. и, следовательно, в каждой конкретной ситуации достигается определенный компромисс между размером ДНК и ее выходом. Эту трудность можно частично преодолеть при использовании лиофилизированного материала (разд. 4.2). Однако высвобождение высокомолекулярной ДНК — это только часть задачи, поскольку экстракты растительных клеток содержат большие количества полисахаридов, таннинов и пигментов, которые в ряде случаев весьма трудно отделить от ДНК. Хуже того, некоторые полисахаридоподобные примеси невозможно определить обычными аналитическими методами, не приводящими к разрушению ДНК- Такие примеси препятствуют правильному определению количества нуклеиновых кислот спектрофотометрическими методами и дают аномальную кинетику гибридизации. Кроме того, что гораздо важнее, они могут подавлять активность большинства ферментов, модифицирующих ДНК, в том числе и ферментов рестрикции. Это может затруднять как анализ ДНК методом блоттинг-гибридизации по Саузерну, так и ее клонирование. [c.237]

Количественный спектрофотометрический анализ. Ряд важных биологических соединений можно полуколичественно изучать с помощью спектрофотометрии в видимой и ультрафиолетовой областях, например, измеряя поглощение белков при 280 нм, а нуклеиновых кислот при 260 нм — длинах волн, соответствующих максимуму поглощения этих соединений. Экстинкция белка при 280 нм зависит от содержания в нем ароматических аминокислот — тирозина и триптофана, поэтому значения молярной экстинкции при 280 нм для всех белков различны, и для определения содержания каждого из них требуется индивидуальная калибровочная кривая. Как правило, биохимики работают со смесью белков, и тогда можно пользоваться градуировочной кривой, полученной для белка или смеси белков со средним содержанием тирозина и триптофана. Это может быть, например, сывороточный альбумин или смесь сывороточных белков. Таким образом, для контрольных измерений надо выбирать соответствующий белок. Проводя измерения при длинах волн, где примесь поглощает больше исследуемого вещества, можно с помощью соответствующих формул оценить количество примеси в образце. Так, пользуясь методом Мортона и Стубса, определяют содержание витамина А в омыленных экстрактах природных масел, а по соотношению экстинкций при 260 и 280 нм (Еш/хо) находят содержание белка в препарате нуклеиновых кислот. [c.155]

Долгое время для определения нуклеотидного состава ДНК и РНК использовали разделение нуклеотидов, нуклеозидов или свободных азотистых оснований, полученных в результате деструкции исследуемых нуклеиновых кислот, при помощи хроматографических методов с последующим спектрофотометрическим анализом природы и содержания каждого из оснований. Однако в последнее время классические методы анализа нуклеотидного состава нуклеиновых кислот заменены физическими методами. Так, содержание ТЦ-пар в составе ДНК сейчас находят по температуре плавления ДНК и по ее плавучей плотности. В первом случае содержание ГЦ-пар связано с температурой плавления ДНК следующей зависимостью ГЦ (мол. %) = ( пл—69,3)-2,44. Эта зависимость справедлива, если ДНК растворена в стандартном солевом растворе (0,15 моль КаС1 и 0,015 моль цитрата натрия в 1 л, pH 7,0). Во втором случае содержание ГЦ-пар прямо пропорционально значению плавучей плотности ДНК, определяемой при ее ультрацентрифугировании в градиенте плотности С8С1. [c.202]