Разделение на сефадексе

Разделение на сефадексе С-25 (2 раза) 16 г 16 [c.256]

Рис. 18.7. Хроматограмма разделения на сефадексе G-50 меченого 4- С-холестерином экстракта

Во всяком случае, здесь выполняется уравнение Больцмана в общем виде (уравнение 15), и концентрация вещества в некоторых участках стационарной фазы может иногда быть выше концентрации в подвижной фазе. Речь идет лишь о том, каким образом Я, зависит от молекулярного веса, т. е. от того, принимает ли Ло в уравнении X = ко - М положительное или отрицательное значение. При истинной адсорбции Яо должно быть отрицательным, т. е. высокомолекулярные соединения сорбируются сильнее, чем сходно построенные низкомолекулярные. На этом факте основаны многочисленные попытки разделения гомологичного ряда полимеров [44]. В последнее время описано разделение на сефадексе ЬН-20, которое в точности соответствует этой схеме [45]. [c.127]

Рис. 4. Зависимость длины пробега (вычисленной по отношению к длине пробега гемоглобина) от логарифма молекулярного веса для ряда стандартных белков при разделении на сефадексе Q-200. Наблюдается аномальное поведение лизоцима, овомукоида и гемоглобина [9].

Наибольшей скоростью прохождения колонки обладают компоненты, не способные проникнуть в зерна гелевой фазы. Сефадексы 0-10 и 0-15 служат для фракционирования низкомолекулярных веществ, первый из них используется для веществ с молекулярным весом до 700, а второй — до 1500. Гели сефадекса 0-25 не способны поглощать, а следовательно, и задерживать перемещение по колонке веществ с молекулярным весом 3500— 4500. Этот предел для сефадекса 0-50 лежит в области значений молекулярных весов 8000—10000, а для сефадекса 0-75 эта величина достигает 40000—50000. Медленно перемещаются по колонке низкомолекулярные вещества, для которых коэффициент распределения между гелевой и жидкой фазами приближается к единице. Во многих случаях компоненты смеси при хроматографическом разделении на сефадексах следуют в порядке уменьшения их молекулярных весов. Однако наблюдается иногда и специфическое сорбционное взаимодействие разделяемых веществ с матрицей сефадекса, что влечет за собой увеличение коэффициента распределения К и снижение скорости перемещения по колонке. Так, замедление движения хроматографических зон наблюдается у основных пептидов и аминокислот в основных растворителях и кислых аминокислот и пептидов в кислых растворителях. Наблюдается также повышение степени удерживания в колонке ароматических веществ при гельфильтрации [22]. Ряд белков, таких как рибонуклеаза, лизоцим, трипсин, бычий сывороточный альбумин, в отсутствие солей также сорбируется и удерживается сефадексом при хроматографии. В связи с этим целесообразно проводить элюирование на сефадексах растворами солей или кислот. [c.202]

Рис. 6.11. Групповое разделение на сефадексе G-25 гемоглобина (/) и хлорида

Рис. 7. Максимальные значения интенсивности люминесценции и оптическая плотность фракции после разделении на сефадексе 0-15 концентрата истока р. Москвы после отделения гуминовых кислот.

Таким образом, применение хроматографического разделения на сефадексах при исследовании растворенных органических веществ речных вод, несомненно, перспективно. Судя по полученным результатам длл разделения окрашенных органических веществ речных вод особенно перспективно использование сильно набухающих сефадексов. Однако правильная информация о составе растворенных органических веществ может быть получена лишь при сохранении неизменными первоначальных форм этих веществ, что возможно, прежде всего, лишь при отсутствии какого-либо химического воздействия в процессе подготовки пробы к фракционированию. Во избежание высаливания высокомолекулярных органических веществ необходимо также предварительно установить допустимую степень концентрирования исходной пробы. [c.162]

Как правило, компоненты смеси при хроматографическом разделении на сефадексах следуют в порядке уменьшения их молекулярных весов. Однако иногда наблюдается специфическое сорбционное взаимодействие разделяемых веществ с матрицей сефадекса, что влечет за собой увеличение коэффициента распределения и снижение скорости перемещения на колонке [19], Такие белки, как рибонуклеаза, лизоцим, трипсин, альбумин сыворотки крови быка, в отсутствии солей сорбируются и удерживаются сефадексом при хроматографии из-за присутствия небольшого количества карбоксильных групп в матрице 359, 368]. Вещества, имеющие положительный заряд, задерживаются и при элюировании образуют хвосты , а отрицательно заряженные будут исключаться из гелевой фазы. Эти побочные эффекты устраняются при использовании растворителей с ионной силой не ниже чем 0,02 [164], [c.130]

Такой детектор регистрирует минимальные тепловые эффекты, имеющие место при взаимодействии растворенного вещества с сорбентом. Измерения проводятся в специальной детекторной колонке, расположенной непосредственно после главной рабочей колонки. Однако кажется сомнительным, чтобы этот остроумный принцип оказался приемлемым для гель-хроматографии, поскольку, согласно доминирующим воззрениям относительно механизма происходящих в колонке процессов, вещества с гелем не взаимодействуют (см. гл. П1). Тем не менее при разделении на сефадексе G-10 олигомерных полисахаридов и про-пиленгликолей их удалось надежно определить в элю-ате с помощью детекторной колонки [49] приборы такого типа выпускаются фирмой Bio- al (Mun hen, BDR). [c.67]

Два интересных эксперимента по разделению на сефадексе G-25 заимствованы из области препаративной органической химии многие ароматические сульфокислоты [178], а также смесь таутомеров фе нилпировиноградной кислоты [179] удается эффективно разделить благодаря тому, что компоненты этих смесей имеют различное сродство к гелю. (О разделении низкомолекулярных соединений различных классов с помощью гель-хроматографии см. литературу, приложение VI.) Более того, пожалуй, не будет ошибкой считать, что сродство к фазе геля играло [c.192]

В гл. IV мы показали на двух примерах (см. стр. 148), что с помощью сефадекса G-25 можно определить число центров связывания в молекуле фермента, или сродство ферментов к различным реагентам, а также изучить влияние кофакторов на фермент (см. стр. 142). Аналогичным образом, измеряя способность к связыванию восстановленного ДПН, удалось найти эквивалентный вес семи дегидрогеназ (30 000— 40000) [20]. Иногда образуются стабильные комплексы фермента с реагентом, как, например, при действии свободной от цинка карбоксипептидазы на пептидный субстрат [21]. Этот комплекс, который с помощью гель-хроматографии можно отделить от избытка субстрата, уже не активируется ионами цинка. Очистка гель-фильтрацией на сефадексе G-50 является стандартным приемом при определении металла в карбоксипепти-дазе [22]. Лизоцим образует нерастворимый комплекс с продуктом, получающимся при действии этого фермента на- определенный гликопептид. Растворение этого комплекса (в растворе Na l) и последующий анализ с помощью гель-хроматографии на сефадексе (j-75, а затем на G-25 дает информацию о кинетике ферментативной реакции [23]. При добавлении цито-хромоксидазы к избытку цитохрома с и последующем разделении на сефадексе G-200 в некоторых случаях получают высокомолекулярную фракцию, содержащую эквимолярные количества обоих ферментов эта фракция есть по сути не что иное, как часть дыхательной цепи [24]. В некоторые ферменты цикла лимонной кислоты, для которых кофактором служит биотин, удалось ввести метку (С Ог) в результате реакции с соответствующими субстратами с последующей очисткой на сефадексе G-50 это дало возможность после деградации под действием проназы [c.214]

Однако некоторые макромолекулы в процессе гель-хроматографирования ведут себя аномально и не подчиняются указанному соотношению. Такие отклонения наблюдались, в частности, при разделении на сефадексе белков с сильно асимметричными молекулами и некоторых гликопротеинов. Как показал Девидсон [10], эти аномалии можно существенно уменьшить или даже избежать их, если вести хроматографирование в диссоциирующей среде 6М раствора гуанидингидрохлорида на сефарозе 6В. [c.390]

Баркер с сотр. [63, 72] проводили разделение на сефадексе G-100 окрашенных компонентов экстракта из почвы, полученного с помошью 0,6 н. H2SO4, от высокомолекулярных полисахаридов. На сефадексе удалось отделить от окрашенных компонентов только экстракт полисахаридов в разбавленной кислоте, на основании чего был сделан вывод о том, что присутствие кислоты необходимо для отделения полисахаридов от окрашенных органических компонентов почвы. [c.286]

Эксперименты по хроматографическому разделению на сефадексах проводили следующим образом сефадексы, набухщие в воде в течение одних суток, загружали в колонки [5, 6]. Высота слоя сефадекса 45 см. В колонку вводили 2—5 мл исследуемого раствора и промывали колонку бидистиллированной водой. Скорость элюирования 0,2—0,3 мл/мин. [c.154]

Для достижения наивысшего разрешения необходимо, чтобы свободный объем хроматографического слоя находился в равновесии с внутренним объемом гранул. При гель-фильтрации смесей веществ с приблизительно одинаковыми размерами молекул это возможно только при очень низких скоростях потока. Таким образом, при установлснпи скорости потока необходимо учитывать время разделения и разрешающую способность. В аналитической работе основная роль принадлежит разрешению, тогда как в препаративных опытах важнее быстрота разделения. При гель-фильтрации на сефарозах используется скорость от 2 до 8 мл/см7мин, при обессоливании на сефадексе 0-15 хорошие результаты получают при скорости 12 мл/см /мин, а при разделении на сефадексе 0-200 скорость может составлять от 5 до 20 мл/см /мин. [c.232]

После разделения на сефадексах G-25, G-100 и хроматографирования методом ступенчатого градиента на ДЭАЭ-целлюлозе препарат фермента разделили на три группы, различающиеся как по изоэнзимному спектру, так и по активности. Общая активность препарата очищенной пероксидазы из контрольных растений была практически в 2 раза ниже активности препарата фермента, выделенного из инфицированных листьев. Неизменным оставался коэффициент отношения исходной активности к очищенной, как в опыте, так и в контроле он был равен 1,8. Этот показатель свидетельствует о том, что выделен препарат фермента, сохраняющий свою каталитическую нативность (табл. 8). Профиль элюции с ДЭАЭ-целлюлозы и электрофореграммы изоэнзимов фермента представлены на рис. 6 и 7. [c.66]

Согласно данным табл. 13, препарат фермента очищен в 250 раз. Хроматографический профиль элюции пероксидазы после разделения на сефадексе С-100 идентичен для здоровых и инфицированных растений (рис. 12). Фракции с наибольшей пероксидазной активностью (отмечены штрихом) использовали для последующей работы. Методом диск-электрофореза в спектре пероксидаз, выделенных из здоровых и вирозных [c.74]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология