Промоторы, идентификация

Объектом исследования химической кинетики является химический процесс превращения реагентов в продукты. Можно возразить, что химическая реакция является предметом исследования и ряда других химических дисциплин, таких как синтетическая и аналитическая химия, химическая термодинамика и технология. Следует отметить, что каждая из этих дисциплин изучает химическую реакцию в своем определенном ракурсе. В синтетической химии реакция рассматривается как способ получения разнообразных химических соединений. Аналитическая химия использует реакции для идентификации химических соединений. Химическая термодинамика изучает химическое равновесие как источник работы и тепла и т. д. Свой специфический подход к химической реакции имеет и кинетика. Она изучает химическое превращение как процесс, протекающий во времени по определенному механизму с характерными для него закономерностями. Это определение нуждается в расшифровке. Что именно в химическом процессе изучает кинетика Во-первых, реакцию как процесс, протекающий во времени, ее скорость, изменение скорости по мере развития процесса, взаимосвязь скорости реакции с концентрациями реагентов - все это характеризуется кинетическими параметрами. Во-вторых, влияние на скорость и другие кинетические параметры реакции условий ее проведения, таких как температура, фазовое состояние реагентов, давление, среда (растворитель), присутствие нейтральных ионов и т. д. Конечный результат таких исследований - количественные эмпирические соотношения между кинетическими характеристиками и условиями проведения реакции. В-третьих, в кинетике изучают способы управления химическим процессом с помощью катализаторов, инициаторов, промоторов, ингибиторов. В-четвертых, кинетика стремится раскрыть механизм хи- [c.15]

Для эффективной экспрессии любого гена совершенно необходимо наличие сильного регулируемого промотора, расположенного перед данным геном. Такой промотор имеет высокое сродство к РНК-полимеразе, поэтому прилегающие к нему последовательности эффективно (с высокой частотой) транскрибируются. Регулируемость промотора позволяет клетке (и исследователю) осуществлять строгий контроль транскрипции. Для экспрессии клонированных генов широко используется промотор хорошо изученного la (лактозного)-оперона Е. соН. Однако есть и другие промоторы, обладающие полезными для контроля экспрессии свойствами. Для их идентификации перед так называемым геном-репортером, кодирующим легко регистрируемый продукт, но лишенным [c.105]

Одним из основных этапов в получении трансгенных животных, продуцирующих гетерогенный белок с молоком, является идентификация промотора, который будет направлять экспрессию в секреторный эпителий молочной железы. В настоящее время выделены промоторы а81-ка-зеина, Р-казеина, а-лактоальбумина, Р-лактоглобулина и сывороточного кислого протеина (WAP). [c.239]

Методы генетической трансформации позволяют не только вводить новый генетический материал в культурные растения, но также идентифицировать и изучать последовательности нуклеотидов, контролирующие экспрессию генов. При разработке любого проекта по генетической инженерии для получения контролируемой экспрессии в нужных тканях на соответствующей стадии жизненного цикла следует обращать самое серьезное внимание па манипуляции с изучаемыми генами. Выделение генов, обладающих высоким уровнем экспрессии в определенных органах различных растений на известной стадии жизненного цикла, значительно облегчает идентификацию промоторов, специфически активных в этих тканях и органах, а также позволяет проводить фундаментальные исследования экспрессии генов в онтогенезе. Таким образом, определены и используются в настоящее время для получения трансгенных растений нуклеотидные последовательности, которые усиливают или подавляют экспрессию генов в зависимости от воздействий окружающей среды (например, света или стресса). В данной главе описываются некоторые основные свойства генов растений, и, кроме того, изложены некоторые подходы к изучению организаций перенесенных генов методом блоттинг-гибридизации по Саузерну (разд. 6.2) и экспрессии генов в трансгенных растениях. [c.304]

Трансгенные животные как продуценты ценных биологически активных белков и гормонов имеют ряд преимуществ перед микроорганизмами и клеточными системами. Важно, что новые белки, получаемые в линиях клеток трансгенных животных, могут бьггь модифицированы, их активность сравнима с активностью протеинов. Для молочного производства представляет большой рштерес получение целенаправленной трансгенной экспрессии в эпителиальные клетки молочной железы с целью выхода белков с молоком. Один из основных этапов получения трансгенных животных, продуцирующих гетерогенный белок с молоком, — идентификация промотора, направляющего экспрессию структурных генов в секреторный эпителий молочной железы. [c.131]

Рис. 6.1. Идентификация сильных регулируемых промоторов. В плазмиду встраивают ген-репортер без промотора. Хромосомную ДНК разрезают рестрицирующей эндонуклеазой Abel и встраивают фрагменты в плазмиду. Если ген-репортер эффективно экспрессируется, значит, клонированный фрагмент содержит функциональный промотор.

Визуальная идентификация зон лизиса — утомительная и субъективная процедура. Вместо нее для обнаружения рекомбинантных бакуловирусов можно использовать ДНК-гибридизацию или полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Кроме того, если под контроль промотора бакуловируса, активного с ранних и до поздних стадий литического цикла, поместить ген la Z Е. соН, кодирующий -галакгозидазу, и такую конструкцию включить во фрагмент ДНК, встраивающийся в геном A MNPV, то в присутствии хромогенного субстрата -галактозидазы зоны с рекомбинантными вирусами окрасятся в синий цвет. [c.144]

Для выделения растительных промоторов из некоторых видов растений использовали специализированные так называемые промотор-направленные векторы и систему трансформации на основе Ti-плазмид Agroba terium. Суть подхода состоит в следующем. Репортерный ген без промотора встраивают сразу за правой фланкирующей последовательностью вектора на основе Ti-плазмиды, и после переноса Т-ДНК в хромосому растения он оказывается в окружении растительной ДНК. Если Т-ДНК встроится в промоторный участок функционального гена, то произойдет транскрипция репортерного гена. Для идентификации растительных промоторов в качестве репортерного гена можно использовать ген [c.383]

В 1980 г. Верховный суд США вынес определение, что изобретение, которое включает что-либо, созданное под солнцем руками человека , является охраноспособным. В 1988 г. было запатентовано первое животное, полученное с помощью методов генной инженерии, — трансгенная мышь. В ее ДНК бьш встроен ген, ответственный за образование злокачественных опухолей (онкоген), который находился под контролем промотора на основе длинного концевого повтора вируса опухоли молочных желез мыши (ЬТЯ ММТУ). Онкоген представлял собой ген туе вируса миелоцитоматоза цыпленка ОКЮ. Изобретение заключалось в клонировании химерного гена ЬТК ММТУ—т>>с в плазмиде, введении линеаризованной плазмидной ДНК в мужской пронуклеус оплодотворенных одноклеточных мышиных яйцеклеток, идентификации потомков, экспрессирующих ген туе, и получении линий трансгенных мышей. У животньгх одних линий ген туе экспрессировался в различных тканях, у животных других экспрессия ограничивалась одной или несколькими тканями. По утверждению Ледера [c.538]

Вопросы стабилизации поверхности, отравления и спекания весьма важны для каталитической переработки угля. Поэтому удивительно, что такое ограниченное внимание было уделено идентификации оксидных катализаторов, особенно при отнесении их к селективной поверхности. При исследовании катализаторов гидросероочистки и гидронитроочистки изучение их дезактивации ограничивалось исследованием изменений в общей поверхности и в распределении пор в объеме. Эффекты селективного отравления, спекания и возможного химического изменения активной каталитической поверхности не исследовались. Отсутствие оценки характеристик катализаторов ограничивает понимание эффектов действия промоторов на активность. [c.47]

Для определения точек, с которыми репрессор контактирует в операторе, используются те же подходы, которые мы уже обсуждали в случае взимоотношений полимеразы и промотора (гл. 11). Конститутивные точковые мутации дают возможность идентифицировать отдельные пары оснований, имеющие критическое значение делеции материала с любой стороны позволяют определить концевые точки области связывания. Были проведены эксперименты, в которых связанную и не связанную с репрессором ДНК сравнивали по чувствительности к метилированию или образованию поперечных сшивок в ДНК под действием УФ-облучения. Цель этих экспериментов-идентификация оснований, которые либо защищены, либо более чувствительны к обработкам, когда они связаны с белком. [c.182]

На рис. 15.15 показана нуклеотидная последовательность контролирующей области да1-оперона. Использование других ее стартовых точек при транскрипции определяется условиями инициации. В присутствии активного белка БАК инициация осуществляется в точке, обозначаемой обычно + 1. (Все положения оснований в случае обоих промоторов обозначаются относительно этой точки.) Эта стартовая точка использована для идентификации промотора да1Р1, который содержит последовательность Прибнова между основаниями в положениях — 12 и — 16 и не содержит канонической последовательности — 35. В отсутствие белка БАК оперон еще может транскрибироваться, но инициация происходит в положении — 5. Эта точка соответствует промотору да1Р2, в котором имеется последовательность Прибнова между основаниями в положениях — 17 и — 11. [c.200]

Хотя эти энидемиологические наблюдения и свидетельствуют о том, что заболевания раком можно избежать, задача идентификации конкретных факторов риска и механизмов их действия остается трудной. Некоторые из этих факторов - явные мутагенные опухолевые инициаторы, неносредственно вызывающие генетические изменения другие преимущественно служат опухолевыми промоторами, увеличивая популяцию клеток, способных вызвать рак нри дальнейших мутациях. Канцерогены, содержащиеся в табачном дыме, как и афлатоксин (см. рис. 21-6), относятся главным образом к первой категории ко второй можно отнести, нанример, женские половые гормоны (рис. 21-14). [c.458]

Недавно сконструированы векторы, содержащие промоторы SP6, Т7 или ТЗ, непосредственно примыкающие к сайтам для клонирования ([8] и неопубликованные результаты). Это позволяет быстро и легко приготовить меченные згр РНК-зонды, специфичные в отношении концов клонированной ДНК и поэтому очень подходящие для использования в качестве зонде в для идентификации новых космид, вставки в которых перекрываются со вставкой в исходной космиде. Этот процесс выделения перекрывающихся клонов известен как прогулка по геному, причем использование промоторных систем SP6/T7/T3 может существенно уменьшить время и труд, затраченный на проведение такой прогулки , поскольку при этом отпадает необходимость в идентификации концов клонированных фрагментов с помощью рестрикционного картирования и физического выделения этих фрагментов для приготовления новых зондов. [c.65]

Еще одно изменение стандартного алгоритма связано с невозможностью точной идентификации нуклеотидов, образующих промотор. Экспериментально можно точно определить, с какого места начинается синтез РНК, но какие именно нуклеотиды образуют -10 и -35 блоки остается еизвестным. Эти блоки могут находиться на разном удалениии от точки инициации транскрипции, расстояние между ними также варьирует в значительных пределах. Поэтому одной зкспериментально определенной точке начала транскрипции могут соответствовать несколько положений признаков промотора. Задача выбора оптимального положения признаков относится к общей проблеме множественного выравнивания (раздел 4.6), окончательного решения которой еще не найдено. [c.140]

Потеря онкогенных свойств означает, что в этом случае трансформированные ткани невозможно идентифицировать как неопластические выросты, клетки которых легко селектировать по их способности к росту на среде, не содержащей фитогормонов. Для разрешения проблемы идентификации трансформированных клеток между повторами длиной 25 п. н. встраивают бактериальные гены устойчивости к антибиотикам, помещенные под контроль промоторов Т-ДНК и снабженные сигналами полиадени-лирования. Такие химерные гены устойчивости к антибиотикам эффективно экспрессируются в растительных клетках как доминантные признаки в любом генетическом окружении. Удобно, чтобы маркерные гены были тесно сцеплены с чужеродной ДНК по двум причинам. Во-первых, это позволяет осуществлять прямую селекцию трансформированной ткани растения, чтобы убедиться в переносе чужеродной ДНК. И во-вторых, это гарантирует, что фланкирующая чужеродная ДНК в конкретном трансформированном клоне, полученном в результате селекции, не была встроена в нетранскрибируемую область генома. [c.18]

К наиболее полезным для анализа модификациям в структуре гена относятся замена одного нуклеотида или группы нуклеотидов, делеции или вставки нескольких нуклеотидов или протяженных участков ДНК и перестройки внутри гена. Ниже мы обсудим, каким образом эти модификации используются для идентификации регуляторных последовательностей, которые обеспечивают правильную экспрессию гена и отвечают за его тканеспецифичную и зависящую от времени регуляцию. Кроме того, изучение новых генов, образующихся при слиянии частей различных генов, очень облегчает идентификацию последовательностей, ответственных за правильную экспрессию. Например, слияние промотора SV40 и различных его производных с последовательностями, кодирующими легко идентифицируемые бактериальные или эукариотические клеточные белки, позволяет выяснить, какие последовательности промотора обеспечивают правильную инициацию, эффективность и регуляцию транскрипции гена SV40. Аналогичные химерные гены, содержащие, например, промоторы генов инсулина или эластазы, слитые с областью, кодирующей Т-антиген SV40, позволяют идентифицировать элементы, ограничивающие экспрессию генов инсулина или эластазы исключительно Р-клетками островков Лангерганса или ацинарными клетками соответственно. Для применения методов обратной генетики необходимо, чтобы существовал один или лучше несколько способов определения фенотипического проявления измененного гена. Соответствующие бесклеточные системы, с помощью которых можно определять эффективность транскрипции нормальных и модифицированных генов, а также изучать процессинг или трансляцию РНК, дают прекрасную возможность для анализа функции генов и последствий отдельных изменений в них. Трансфицируя нормальные и модифицированные гены с помощью [c.20]

Полипептидные факторы транскрипции. Большое число факторов, предположительно участвующих в транскрипции ранней области SV40. было выделено из клеточных экстрактов, способных осуществлять транскрипцию с промотора ранней области. Для их идентификации, очистки и изучения применялись разные методы. Некоторые факторы специфически связываются с конкретным элементом, о чем свидетельствует их способность защищать определенные основания в этом элементе от расщепления ДНКазой 1 (футпринтинг разд. 8.2.в), а также уменьшение электрофоретической подвижности ДНК, содержащих такой элемент, при связывании его с белком (смещение полосы). Имеются данные о восстановлении транскрипционной активности в экстрактах, обедненных определенными факторами, при добавлении последних, а также об отсутствии такого восстановления в том случае, когда сайты связывания разрушены. Это указывает на то, что связывание данных факторов активирует транскрипцию. Клонированы и секвенированы гены, кодирующие некоторые факторы транскрипции. Их экспрессия в Е. соН и способность синтезированных продуктов активировать транскрипцию in vitro позволяют идентифицировать важные домены белков. [c.54]

Во всех проведенных к настоящему времени опытах промотор ТК исследовали в отсутствие 1ЕРЗ. Участвуют ли какие-то другие элементы в активации транскрипции под действием этого белка По-видимому, на этот вопрос следует ответить отрицательно, поскольку опыты по трансфекции с использованием таких же мутантов, как и при идентификации элементов промотора, показывают, что для активации транскрипции с участием IEP3 in vivo нужна только область между парой оснований [c.60]

В результате связывания активированных гор-мон-рецепторных комплексов с соответствующими HRE осуществляется регуляция транскрипции, которая в зависимости от промотора, вероятно, состоит в активации или ингибировании инициации этого процесса. Один из подходов к изучению механизма активации или подавления транскрипции при связывании рецептора заключается в идентификации областей рецептора, ответственных за влияние на транскрипцию. В этом случае тоже применяли подход, основанный на внесении мутаций в кДНК, кодирующие рецепторы стероидов, гормонов щитовидной железы, вита.мина Dj и ретиноида, и на сопоставлении их с изменениями в регуляции транскрипции с участием соответствующих HRE. Предпосылкой регуляции транскрипции является связывание с ДНК комплекса рецептор-гормон, поэтому возникает вопрос какие именно структуры рецептора опосредуют регуляторный эффект Результаты исследований в целом свидетельствуют о том, что в регуляции участвуют многие области рецептора, причем наиболее важны области А/В и Е. Однако относительная значимость этих двух областей варьирует у разных рецепторов и среди разных промоторов, содержащих одинаковые HRE. Например, если область Е рецептора эстрогена удалена, то рецептор сохраняет способность связываться с ДНК, но не может нормально активировать транскрипцию с некоторых промоторов, чувствительных к эстрогенам. В то же время, несмотря на то, что делеции в областях Е некоторых рецепторов препятствуют связыванию с гормоном, не мешая при этом связыванию с ДНК, их влияние на активацию транскрипции носит разный характер в зависимости от промотора, а в ряде случаев и от клеток, в которых исследуется действие рецептора. Мутации в области А/В уменьшают эффективность активации транскрипции с участием связанного рецептора, но степень этого уменьшения зависит от рецептора и гена-мишени. Так, рецептор эстрогенов, целиком утративший область А/В, все еще связывается с эстро-ген-акцепторным элементом двух исследованных промоторов, но в одном случае эффективность активации транскрипции почти нормальная, а в другом активации вообще не происходит. [c.77]

В 1986 г. были идентифицированы два фактора, связывающиеся с промотором (Staudt et al 1986). С целью идентификации небольшой фрагмент ДНК. содержащий окта-бокс, инкубировали и ядерных экстрактах из различных клеток, За гем полученные продукты фракционировали в геле. Если ядерный экстракт не содержал белка, связывающегося с этой ДНК. то небольшой фрагмент ДНК быстро двигался через гель. Однако если какой-либо белок (к йст ите.1ыю присоединялся к этой ДНК. го сс миграция через гель затруднялась. Этот оныг по сдвигу подвижности (рис, 12.16) показал, что каждое ядро содержит но крайней мере один фактор, способный присоединяться к данному фрагменту ДНК. Кроме того, клегки В-ряла (пре-В-клетки. В-клетки и плазматические клетки) дополнительно содержат еще один фактор, специфически связывающийся с ДНК окта-бокса. Эти ДНК-связывающие белки были изолированы, и белок, специфический [c.152]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология