Методы исследования фермент-субстратных комплексов

Методы исследования фермент-субстратных комплексов [c.669]

В последнее время появились экспериментальные возможности выделения и изучения некоторых промежуточных продуктов ферментативных реакций, например ацильных производных ферментов гидролиза сложных эфиров (трипсин, химотрипсин и пр.) и некоторых других. Однако в области исследования фермент-субстратных комплексов кинетический метод пока, пожалуй, единственно реальный. [c.50]

Третья причина развития теоретической энзимологии за последние десятилетия главным образом в терминологическом и популяризационном планах связана с рядом ограничений самого рентгеноструктурного анализа. Во-первых, несмотря на уникальность и ценность этого метода как практически единственного источника информации о трехмерных структурах белков, получаемые им результаты касаются только статического состояния фермента и, следовательно, прямо не отвечают на вопрос о динамических конформационных и электронных характеристиках активной конформации, что представляет первостепенный интерес в изучении биокаталитического процесса. Выявление потенциальных возможностей объектов исследования и предсказание их поведения - прерогатива теоретического подхода. Во-вторых, рентгеновский метод позволяет расшифровать трехмерные структуры комплексов ферментов, но комплексов не с субстратами, а с ингибиторами. Могут быть получены структурные данные о целой серии ингибиторных комплексов одного фермента, которые в той или иной мере (но всегда неявной) соответствуют химическим элементарным стадиям каталитического акта. Однако в таком наборе все ингибиторы отличаются по своему химическому и пространственному строению как от истинного субстрата, так и друг от друга. Не зная продуктивной ориентации субстрата в активном центре, а также актуальных для катализа фермент-субстратных взаимодействий и обусловленных ими конформационных перестроек и имея дело со сложной системой, трудно составить полное и объективное представление о причинах спонтанного протекания каталитической реакции. Предпринимаемые здесь попытки представляют собой стремление воссоздать механизм каталитического акта, располагая структурными данными, одна часть которых отвечает реальному, исходному состоянию фермента, а другая, большая часть, фермент-ингибиторным комплексам, которые в чем-то (в чем именно, неизвестно) отличаются от промежуточных продуктивных комплексов истинного многостадийного процесса. [c.106]

Исследование ферментативных реакций в предстационарном режиме нуждается в специальной экспериментальной технике, поскольку используемые методы должны иметь достаточно высокую временную разрешающую способность. Мертвое время экспериментальной методики должно быть существенно меньше времени протекания реакции в предстационарном режиме. В качестве примера рассмотрим случай реакции с участием одного промежуточного соединения. Экспериментальную методику можно считать удовлетворительной, если ее мертвое время будет меньше величины т [см. уравнение (5.109)]. Используя наиболее характерные для ферментативного катализа значения констант скоростей, можно оценить величину т. Величина константы скорости образования фермент-субстратного комплекса ( 1) для большинства ферментативных реакций лежит в диапазоне 10 —10 М" X Хс (см. гл. VII). Типичное значение Кт, характерное для многих ферментативных реакций, равно 10 М. Если положить минимальную концентрацию субстрата равной 10" М (эту концентрацию еще можно определить чувствительным спектрофотометрическим методом), зна-чениет будет лежать в диапазоне 10 —10" с. Это показывает, что для исследования предстационарной кинетики ферментативных реакций необходима специальная экспериментальная техника, позволяющая регистрировать кинетические процессы в микро- и миллисекундном временном диапазоне. [c.204]

Раскрытие с помощью метода рентгеноструктурного анализа пространственного строения ряда ферментов явилось надежной основой для построения рациональных схем механизма их действия. В одних случаях эти схемы основываются почти целиком на анализе структуры фермент-субстратных комплексов а кристалле, а в других — используются также результаты исследований по химической модификации ферментоа, кинетике катализируемых реакций и другие данные. Установление механизма действия ферментоа имеет ключевое значение для раскрытия структурно-функциональных взаимосаязей во множестве биологически актианых систем. В данном разделе приведены сведения о механизме действия ряда ферментов они могут служить иллюстрацией используемых подходов. [c.188]

В связи с этим в последние десятилетия в ферментативной кинетике получили развитие методы изучения предстационар-н ы X стадий процесса — методы нестационарной кинетики. Поскольку фермент-субстратные комплексы образуются обычно с очень большой скоростью (константы скорости имеют нередко величины 10 — 10 се/с ), исследование нестационарной кинетики требует применения специальных методов высокоскоростной регистрации хода процесса. С этими методами можно ознакомиться в специальной литературе [7, 8]. [c.20]

Однако первая стадия наиболее ответственна, поскольку сама вероятность каталитического акта строго определяется возможностью образования комплекса Михаэлиса. Первично образующееся соединение фермента с субстратом носит название комплекс не вследствие его прямого отношения к классу комплексных соединений, как это понимается в химии, а, скорее, потому, что реальная природа этого соединения пока неизвестна. В огромном большинстве случаев также неизвестны достаточно точно те химические взаимодействия, которые обеспечивают образование комплекса неизвестны и механизмы первичного перераспределения электронов в молекуле субстрата на стадии возникновения первичного комплекса. Более того, до сравнительно недавнего времени мы не имели прямых экспериментальных доказательств реальности существования самих комплексов, которое вытекало в основном из кинетических данных. В 1943 г. были проведены спектральные исследования, свидетельствовавшие о возможности образования промежуточных фермент-субстратных соединений например, в опытах Чанса [13] спектрофотометрическим методом было показано образование комплекса пероксидазы с Н2О2. Были попытки обнаружить фермент-субстратный комплекс методом зонального электрофореза [14]. Однако все эти результаты получены непрямыми методами. В 1963 г. японским авторам Яги и Озава [15] удалось получить прямые доказательства реальности комплекса Михаэлиса. Они выделили стабильный в анаэробных условиях кристаллический комплекс оксидазы D-аминокислот (D-аминокислота О 2 — окси-доредуктаза, КФ 1.4.3.3) с D-аланином (рис. 6). Этот комплекс содержал, помимо апофермента и субстрата, флавинадениндинукле- [c.48]

Положительный результат использования метода Мэйна был получен Треси [12] при исследовании дрожжевой р-амилазы (старое название — инвертаза) (КФ 3.2.1.2). Автор применял в качестве ингибитора распада фермент-субстратного комплекса анилин (в концентрации 0,5—2,0 10" М), а в качестве [c.55]

Для современных энзимологов существование фермент-субстратных комплексов — почти аксиома. В настоящее время накопилось огромное множество кинетических и других данных, подтверждающих образование таких комплексов в ходе ферментативных реакций, причем многие из них очень трудно объяснить каким-либо иным образом. Наиболее убедительны с этой точки зрения многочисленные прямые наблюдения образования соединений фермента с субстратом. Первое из них — наблюдение осаждения папаина его субстратом фибрином [1] — относится к 1880 году последние известные нам работы такого рода — исследования кристаллического фермент-субстратного комплекса оксидазы О-ами-нокислот с помощью оптических методов и метода ЭПР [2—5]. Классическими примерами служат гемопротеиды— пероксидаза и каталаза [6, 7], для которых образование промежуточных комплексов было доказано с помощью прямых спектроскопических методов более 30 лет назад [8, 9]. Позднее прямые доказательства образования подобных комплексов были получены с помощью самых разнообразных методов при исследовании гидролитических ферментов [10—14], альдолаз [15, 16], ряда дегидрогеназ [17—21] и тиотрансферазы ро-данезы [22, 23]. [c.55]

Недавние исследования динамики молекулы лизоцима с помощью кристаллографических методов показали [55, 56], что атомные смещения в белке наиболее выражены в области активного центра фермента. Хотя эти исследования иока носят лишь постановочный характер, не исключено, что в будущем применение рентгеноструктурного анализа именно для изучения динамических свойств молекул белка (определение средних амплитуд смещения каждого атома от его усреднеппой позиции в кристалле), помимо зарекомендовавших себя исследований статических свойств белковых молекул в кристалле (оиределение усредненных координат всех атомов в молекуле на основе соответствующего распределения электронных плотностей), может дать важную и принципиально новую информацию о структуре ферментов н механизмах их действия. Далее, обещающими являются новые возможности прямого рентгеиоструктурного анализа промежуточных состояний в ферментативном катализе путем охлаждения кристаллов фер-мент-субстратного комплекса в подходящих водноорганических растворителях и определепия структуры образующихся молекулярных комплексов непосредственно в ходе реакции [57, 58]. Этот [c.158]

Дальнейшее развитие изящных релаксационных методов представляет большой интерес. Путем сочетания метода остановленного потока и метода температурного скачка [16, 17] уже удалось получить весьма важную новую информацию о механизме действия ри-бонуклеазы, позволившую сформулировать представление о деталях процесса, катализируемого этим ферментом [17]. Сочетание этих двух методов применимо в тех случаях, когда положение равновесия изучаемой суммарной реакции таково, что равновесный фермент-субстратный комплекс, лимитирующий весь процесс, содержит лишь один из реагентов. Для изучения комплексов с другими реагентами фермент и исследуемый реагент смешивают в быстром потоке, который останавливают в ячейке для температурного скачка. После этого проводят исследование релаксационным методом в тот период времени, когда реакция еще не достигла такой степени, что прочно связанный продукт накапливается в количестве, мешающем измерению. [c.189]

Таким образом, при ферментативном катализе активация субстрата происходит путем образования нестойкого промен уточного фермент-субстратного комплекса. Изучение этих комплексов представляет большие трудности, так как в основном они неустойчивы, быстро разрушаются и резко различаются по размерам обоих компонентов, что сильно затрудняет исследование. Однако с помо1цыо оптических методов удалось [c.228]

Наиболее обширную информацию о фермент-субстратных взаимодействиях получают при исследовании кристаллических ферментов и их комплексов с ингибиторами и субстратами методом рентгеноструктурного анализа. Найденные этим способом координаты атомов фермента и субстрата затем оптимизируются путем минимизации энергетических потенциалов, задаваемых суммой атом-атомных взаимодействий (см. гл. VIII-IX). Построенные в результате энергетические карты (см. 1, гл. IX) фермент-субстратных комплексов позволяют сравнивать конформации отдельных фрагментов белка и аминокислотных остатков в связанном и свободном состояниях. В настоящее время насчитывается сравнительно небольшое число таких исследований. [c.422]

Д. Миозиновая АТРаза определение констант скорости ассоциации и диссоциации фермент-субстратного комплекса, исследование промежуточных конформационных состояний и равновесий методом остановленной струи с регистрацией флуоресценции, методом высвобождения протонов, измерением ферментативной активности при помощи вспомогательных ферментных систем, методом светорассеяния и методом замороженной струи [c.238]

Мы подчеркнули важное значение молибдена для растений, однако он входит в состав и некоторых ферментов, содержащихся в животных организмах. Он участвует в окислении пуриновых оснований в мочевую кислоту. Ксантиноксидаза и родственный ей фермент альдегидоксидаза обладают двойственной субстратной специфичностью. Оба эти фермента катализируют окисление многих гетероциклических азотсодержащих соединений, а также альдегидов и, по-видимому, используют кислороде качестве физиологического конечного акцептора электронов. Третий фермент — ксан-тиндегидрогеназа — имеет близкие функциональные свойства, но, вероятно, использует НАД в качестве акцептора электронов. Спектры ЭПР этих молибденсодержащих ферментов существенно различаются. Это может означать, что различия между ферментами, по крайней мере отчасти, определяются тонкими различиями в составе комплекса молибдена, связанного с простетической группой. Сравнительно недавно к списку молибденсодержащих ферментов была добавлена сульфитоксидаза. Наличие в ней молибдена было случайно обнаружено при исследовании методом ЭПР гемового компонента [6. Роль этих ферментов млекопитающих изучена слабо. Однако в литературе описан случай смерти ребенка в возрасте 23 месяцев с нейрологическими и другими патологическими нарушениями, по-видимому связанными с отсутствием в организме сульфитоксидазы [7]. [c.261]

Спектры ЭПР дают группировки с неспаренными электронами. К ним относятся парамагнитные ионы металлов, что, например, оказалось очень полезным при исследовании металлоферментов, содержащих Си и Мо [53—55]. Впервые для изучения киназных реакций этот метод использовали Кон и Таунсенд [56], которые таким способом измерили константы устойчивости некоторых комплексов субстратов с марганцем. Последнее оказалось возможным благодаря тому, что амплитуда сигнала от комплекса гораздо меньше, чем от овободного металла. Кро ме этого случая, ЭПР-спбктроскопия марганца успешно использовалась совместно с измерениями протонного резонанса для определения концентрации свободных ионов Мп2+ [35, 57]. Другие попытки использования этого метода, основанные на парамагнитных свойствах марганца, оказались неудачными. Было очень трудно получить сами спектры комплексов и еще труднее их интерпретировать. Однако благодаря этим измерениям были получены доказательства, позволившие Кон разделить киназы на две группы тип I (например, креатинкиназа) и тип И (например, пируваткиназа) в соответствии с тем, как ион металла реагирует с ферментом — через субстратный мостик (Е—S—М) или непосредственно (Е—М—S) (см. разд. 2.6.2. и гл. 14). [c.670]