Клонирующий вектор системы

Смит Д.П. Нитевидные фаги в качестве клонирующих векторов // Сельскохозяйственная биология Векторные системы молекулярного клонирования. М. Мир, 1991. С. 65-90. [c.121]

При конструировании гибридов на основе векторных молекул ДНК фага А или фагов серии М1 Зтр удается осуществлять прямой отбор клонов гибридных фагов. В случае же использования плазмидных векторов прямой отбор клеток, содержащих гибридные плазмиды, часто невозможен. Поэтому возникла необходимость в разработке векторных плазмид с системой прямой селекции гибридных вариантов. Предпринятые исследования привели к созданию широкого спектра таких клонирующих векторов некоторые из них мы рассмотрим. [c.118]

ДНК попадает в ядро. Однако вирусные векторы имеют ряд недостатков они дорогостоящи и часто обладают ограниченной клонирующей емкостью, что не позволяет регулировать экспрессию терапевтического гена с помощью тканеспецифичных последовательностей. Кроме того, вирусные белки могут вызывать воспалительную реакцию, что исключает повторное введение вектора. Поэтому были разработаны невирусные системы доставки генов. [c.499]

Для наработки моноклональных антител надо индуцировать сильный иммунный ответ. Для этого необходимы достаточно большие количества иммуногена. Выделение же больших коли честв нативного белка не всегда представляется возможным. Однако клонирование гена в подходящем бактериальном экспрессирующем векторе способно обеспечить повышенное образование кодируемого белка, делает возможным использование очищенного белка в качестве иммуногена. Такая система позволяет клонировать определенные фрагменты меньшего размера, входящие в состав гена известного белка, или, наконец, откры- [c.171]

Векторная система ампликона вируса простого герпеса имеет ряд особенностей, отличающих ее от эукариотических векторов других типов. Гибридная ДНК, состоящая из ампликона, соединенного с чужеродной последовательностью, реплицируется по механизму катящегося кольца и упаковывается в капсид как линейная молекула размером около 150 тпн. Поэтому в данном случае можно клонировать фрагменты ДНК, значительно варьирующие по длине. Также необходимо отметить, что популяция вирусов, содержащая гибридные дефектные геномы, может быть использована для инфекции практически любых культур клеток млекопитающих. [c.389]

Один из клонирующих векторов системы слияния, сконструированных для получения специфических антител, содержит 5 "-концевой сегмент гена ompF Е. соН, кодирующего один из наружных мембранных белков, и прилегающую к нему часть гена la Z (Р-галактозидазы) Е. соИ (рис. 6.7). Этот сегмент содержит информацию, необходимую для инициации транскрипции и трансляции химерного гена, а также для секреции химерного белка. Несмотря на то что укороченный ген la Z лищен кодонов для первых восьми аминокислот, кодируемый им белок сохраняет ферментативную активность. В такой [c.113]

Рис. 6.7. Клонирующий вектор системы слияния. Он содержит ген устойчивости к ампициллину (Атр ) в качестве селективного маркера, 5 -концевой сегмент гена ompF, кодирующий N-конец наружного мембранного белка, сайт для рестрицирующей эндонуклеазы АЬс и укороченный ген -галактозидазы (la Z). Ген, который хотят клонировать, встраивают в Ab l-сайт. После транскрипции и трансляции этой генетической конструкции образуется трехкомпонентный химерный белок.

JOT две системы конъюгации — первая для промежуточных векторов на основе репликона olEI, используемых в сочетании с векторами коинтегративиого типа, и вторая для репликона rK2, на основе которого сконструированы многие бинарные векторы. Для обеспечения функций мобилизации (mob) и переноса ira), действующих в транс-положении, используют плазмиды-помощники конъюгации ( хелперные плазмиды), специфичные для репликонов обоих типов, либо на отдельных реп-ликонах, либо интегрированные с хромосомой в специальных хозяйских штаммах агробактерий [36]. Для того чтобы система конъюгации функционировала, клонирующие векторы должны содержать специфичное начало переноса ( ориджин — опТ) и сайт активации bom), на которые действуют продукты генов tra и mob. [c.73]

Векторные молекулы играют важнейшую роль на этапе клонирования ш vivo изучаемых последовательностей ДНК. Конкретные векторы будут рассмотрены в дальнейшем для каждой генно-инженерной системы отдельно. Использование клонирующих векторов позволяет получать необходимый фрагмент ДНК в индивидуальном состоянии и в препаративных количествах. Это подняло на качественно новый уровень исследования структурно-функциональной организации геномов как прокариотических, так и эукариотических организмов (см. 1.7). Разработка и совершенствование экспрессирующих векторов позволяет все с большей определенностью создавать штаммы — суперпродуценты чужеродных белков. [c.32]

Создавая на основе природного репликона удобные клонирующие векторы, необходимо прежде всего достаточно подробно изучить генетическую организацию данной автономно реплицирующейся молекулы ДНК и лишь затем выполнить ряд манипуляций по ее реконструкции. На получение каждого такого вектора, как правило, уходит много времени. Особенно это касается слабо изученных в генетическом плане видов бактерий. Поэтому крайне привлекательным выглядит подход, который предусматривает создание векторных молекул, способных стабильно реплицироваться в различных хозяевах. По сравнению с конструированием отдельных молекулярных векторов для каждого бактериального вида это, во-первых, существенно экономит время и, во-вторых, обеспечивает возможность изучать экспрессию любых генов в различном генетическом окружении в составе одной и той же генетической конструкции. Часто в этой схеме экспериментов грамотрицатель-ная бактерия Е. соИ, как наиболее хорошо разработанная генно-инженерная система, используется в качестве промежуточного хозяина. [c.211]

Параллельно с развитием векторной системы Ba illus на основе стафилококковых и стрептококковых плазмид велась разработка клонирующих векторов и на основе плазмид, выделенных из разных видов бацилл (табл. 10.4). [c.246]

Клонирующие векторы созданы также на основе некоторых других фагов бацилл, не только умеренных, но и вирулентных. Как видим, векторная система клеток В. subtilis на основе ДНК фагов разработана относительно хорошо. Для малоизученных умеренных фагов бацилл предложен метод статистической интеграционной встройки чужеродных генов in vivo в соответствующий профаг. Индуцируя измененные в процессе такой интеграции профаги, получают гибридное фаговое потомство, которое в одних случаях может быть дефектным (размножается в присутствии фага-помощника), а в других — жизнеспособным. По-видимому, такой подход конструирования гибридных фагов применим и к малоизученным умеренным фагам Е. соН. [c.262]

Молекулярные клонирующие векторы играют ключевую роль в постановке генно-инженерных экспериментов на выбранной системе клеток. В системе клеток прокариот и низших эукариот в качестве векторных молекул используют плазмиды или ДНК вирусов. В культивируемых клетках млекопитающих эндогенные плазмиды не найдены, поэтому внимание исследователей сконцентрировалось на ДНК-со-держащих вирусах. К моменту появления генно-инженерной методологии наиболее хорошо изученным в генетическом и биохимическом плане был вирус SV40. Имелись методы наработки и очистки данного вируса, выделения его ДНК и трансфекщ1и ею чувствительных культур клеток. Поэтому именно на основе ДНК вируса SV40 бьши созданы первые клонирующие векторы культивируемых клеток млекопитающих. [c.354]

Векторы для клонирования в таких системах представляют собой двойные репликоны, способные существовать и в . соН, и в той клетке хозяина, для которой они предназначены. С этой целью создают гибридные векторы, содержащие репликон какой-либо из плазмид Е. соИ и требуемый репликон (из бактерий, дрожжей и др.), и первоначально клонируют с последующим отбором требуемых генов в хорошо изученной системе. Затем вьщеленные рекомбинантные плазмиды вводят в новый организм. Такие векторы должны содержать ген (или гены), придающий клетке-хозя-ину легко тестируемый признак. [c.124]

Генетическая селекция in vivo может обеспечить способность организма к разложению специфического вещества. Однако подобные методики нуждаются в длительном периоде селекции (8—10 мес, как описано выше) и основываются на случайном наборе генетического материала для получения желаемой катаболической системы. Использование методов рекомбинантной ДНК дает экспериментатору возможность соединять вместе определенные катаболические последовательности и контролировать экспрессию специфических генов. Уровень экспрессии, определяемый in vivo, зависит от регуляторных механизмов, кодируемых плазмидными последовательностями, и мало что можно сделать, чтобы повлиять на выход отдельных ферментов. Однако можно получить повышенный уровень генного продукта, клонируя определенные гены в векторах по направлению транскрипции промоторных последовательностей. [c.334]

Ген металлотионеина представляет собой еще один амплифицируемый маркер, работа с которым подробно освещена в данной главе. Особенно хорошо изучен один из двух генов мыши m-mtl, этот ген невелик, и его геномную копию удобно клонировать в плазмидных векторах [8]. Попытки использовать данный ген в качестве доминантного селективного маркера окончились неудачей (кроме векторов на основе ВРУ [19]). Поэтому для первичной селекции требуется дополнительный маркерньп ген. Эти недостатки компенсируются в ряде случаев простым и недорогим методом селекции клеток на амплификацию мышиного гена rn-mtl, хотя число копий на клетку в этой системе не превышает 100. [c.244]

Методы, используемые нами для синтеза равномерно меченных и меченных по концам одноцепочечных ДНК-зондов, очень похожи. Принцип их проиллюстрирован на рис. 10. Фрагмент ДНК, который предстоит исследовать, клонируется в репликативной форме бактериофага или в плазмидном векторе, продуцирующем одноцепочечные кольцевые молекулы только одной ориентации. Две наиболее распространенные системы такого типа — бактериофаг М13 и плазмиды, несущие точки начала репликации фага М13. Олигонуклеотидный праймер реассоциируют с одноцепочечной кольцевой молекулой так, чтобы он инициировал синтез ДНК на матрице тестируемой вставки в направлении от 5 - к З -концу. Для равномерно меченных зондов один из используемых при синтезе dNTP метится изотопами Р или в альфа-положении. Для зондов с концевой меткой олигонуклеотид метят по 5 -концу [y- PjATP, а для синтеза ДНК используют холодные dNTP. По окончании синтеза ДНК обрабатывается рестриктазой, расщепляющей кольцевую молекулу у конца вставки, противоположном сайту реассоциации с олигонуклеотидным праймером. В результате такой реакции получается линейный фрагмент ДНК, состоящий частично из двухцепочечного и частично из одноцепочечного участков. Денатурируя ДНК и проводя препаративный электрофорез в поли- [c.167]

Современные ВАС-векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК длиной до 300 т.п.о. и выше. Рекомбинантные молекулы вводятся в клетки Е. соИ с помощью электропорации (см. раздел 3.8), причем эффективность образования трансформантов в 10-100 раз выше, чем при обычной трансформации сферопластов дрожжей векторами семейства YA . Это позволяет уменьшить исходное количество ДНК, необходимое для конструирования репрезентативных клонотек генов (см. гл. 4). При скрининге таких клонотек используются традиционные методы работы с бактериальными колониями. В отличие от Y АС-ДНК, которая находится в клетках дрожжей в линейной форме, ВАС-векторы со вставками, как и традиционные F -факторы, существуют в бактериальных клетках в виде кольцевых суперскрученных молекул. Это облегчает их выделение и последующую работу с рекомбинантными молекулами ДНК в растворе, а кроме того, допускает повторное введение в бактериальные клетки этих ДНК, выделенных мини-препаративными методами. Поскольку рекомбинантные ВАС-векторы существуют в бактериальных клетках в виде одной копии, исключаются совместное клонирование в одной клетке разных фрагментов ДНК и образование химерных молекул, что очень важно для физического картирования больших геномов методами снизу вверх . Весьма существенным свойством системы клонирования, основанной на векторах семейства ВАС, является ее генетическая стабильность. Исходная структура клонированных фрагментов ДНК в пределах точности использованных методов сохраняется в таких векторах даже после 100 серийных пересевов бактериальных клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК. Все вышеперечисленные свойства переводят векторы ВАС в разряд сверхъемких векторов нового поколения. [c.94]

На рис. 9 представлена схема конструирования клонотеки геномной ДНК с использованием космидного вектора. Следует иметь в виду, что общие принципы получения клонотек генов приложимы и к любым другим векторам. На первом этапе конструирования осуществляют подготовку вектора и клонируемой ДНК. Космидный вектор расщепляют рестриктазами ВатШ и Smal, причем рестриктаза Smal расщепляет ДНК с образованием тупых концов. В результате образуются два плеча космидного вектора, содержащих область начала репликации ori, используемую системой репликации бактериальных клеток, и два селектируемых маркера, которые представляют собой гены устойчивости к антибиотикам - ампициллину (Атр ) и канамицину (КапО, а также два со -сайта хромосомы бактериофага X. Параллельно со всеми необходимыми предосторожностями получают препараты высокомолекулярной ДНК, которую необходимо клонировать. [c.156]

Недавно разработанные системы направленного мутагенеза с использованием ПЦР и мегапраймеров позволяют существенно облегчить процесс получения мутаций, что достигается отказом от использования перекрывающихся мутантных праймеров для синтеза мутантных фрагментов ДНК [25, 26]. Принцип этого метода заключается в следующем (рис. 36,а). В первом раунде ПЦР синтезируют мутантный фрагмент ДНК, в который вводят мутации с помощью одного из праймеров (праймер М). Поскольку образующийся продукт ПЦР обладает значительными размерами (его допустимые размеры 70-800 п.о.) и используется в качестве праймера в следующем раунде ПЦР, он получил название мегапраймера. Фрагмент очищают электрофорезом в агарозном геле и используют в качестве праймера во втором раунде репликации со встречным праймером А. Праймеры А и В могут быть универсальными и содержат на своих 5 -концах сайты рестрикции для дальнейшего клонирования фрагмента. Конечный продукт ПЦР, образовавшийся после второго раунда амплификации, длина которого может быть в пределах 400-2500 и.о., после очистки и инкубации с соответствующими рестриктазами клонируют в подготовленном векторе, заменяя исходный фрагмент ДНК на мутантный, полученный с использованием мегапраймера. [c.298]

Большинстворетровирусных векторов создано на базе вируса лейкоза мышей (MT.V) Векторы, в которых сохранились только концевые повторы LTR и is- действующие сайты Р, Ри и psi си. рис. 13.4, а), позволяют клонировать до 8 т.п.н. чужДНК. Полезным свойством таких векторов является полное отсутствие вирусных белков в трансдуцированных клетках, и поэтому in vivo эти клетки не будут восприниматься иммунной системой организма как чужие. Это обстоятельство совместно с фактом, что терапевтический ген интегрируется в клеточную хромосому, обеспечивают стабильность терапевтического эффекта. Однако рет- [c.422]

У бацилл имеется большое разнообразие а-факторов, а следовательно, специфичностей РНК-полимеразы (см. 10.3.1), поэтому особый интерес представляет выделение промоторов различных групп. Так, в векторе pPL703 были клонированы промоторные фрагменты из хромосомной ДНК В. subtilis. При анализе отобранных клонов на возможность продуцировать AT в экспоненциальной и стационарной фазах роста культуры обнаружены фрагменты, направляющие транскрипцию лишь в постэкс-поненциальной фазе. Таким образом, разработанная векторная система позволяет не только клонировать промоторные фрагменты ДНК, но и характеризовать их. [c.245]

Создание набора клонирующих молекулярных векторов и достигнутое понимание организации генов Ba illus дали толчок исследованиям по экспрессии чужеродных генов в В. subtilis. Особое значение для данной генно-инженерной системы имеет секреция целевых белков из клеток в окружающую среду, поэтому существенная часть этих экспериментов описана в разд. 10.2.4. [c.265]

Смотреть страницы где упоминается термин Клонирующий вектор системы: [c.139] [c.293] [c.379] [c.379] [c.550] [c.30] [c.195] [c.93] [c.161] [c.225] [c.240] [c.260] [c.278] [c.231] [c.88] [c.88] [c.200] [c.66] [c.256] [c.298] [c.251] [c.269]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология