Пептиды специфичные, выделение

Важно было доказать, что эти пептиды входят в состав молекулы инсулина, а не образуются в процессе расщепления белка. Сенгер прекрасно понимал, что ценность полученных им результатов в значительной степени зависит от решения этого вопроса и придавал большое значение вопросу специфичности выделенных им пептидов. Ему удалось показать, что во всех случаях последовательность концевых отрезков была одинакова. Это в значительной степени отводило возражения о возможном синтезе этих пептидов из образовавшихся аминокислот, так как предложенный О. Беренсом и М. Бергманом синтез, основанный на [c.133]

Окисленная рибонуклеаза. Действие химотрипсина на рибонуклеазу менее специфично, чем действие на этот субстрат трипсина. Об этом свидетельствуют более низкие выходы полипептидов при разделении гидролизата методом ионообменной хроматографии [154]. В выделенных полипептидах установлено наличие 151 аминокислотного остатка, в то время как в полипептидах, полученных в результате расщепления трипсином, обнаружено всего 124 остатка. По-видимому, это объясняется тем, что некоторые участки полипептидной цепи появляются более чем в одном из пептидных обломков. О более сложном составе гидролизата можно судить по небольшим количествам примесей (как правило, не выше 15%), присутствующих в большинстве основных фракций. Эти примеси не мешали определению аминокислотного состава фракций, но их присутствие еще раз подчеркивает трудности, которые встречаются при фракционировании смесей пептидов, полученных менее специфическими методами гидролиза. Гидролизаты рибонуклеазы были получены инкубированием в течение 24 час с ферментом при pH 7. При более кратковременном инкубировании гидролизат содержал дополнительно [c.204]

Несмотря на низкую специфичность пепсина, из гидролизата цепи А инсулина был выделен большой N-концевой пептид, состоящий из тринадцати аминокислотных остатков, что в сочетании с данными по составу пептидов, образующихся в результате частичного кислотного гидролиза, позволило установить последовательность аминокислот в цепи А инсулина [267]. [c.209]

Шредер [278] также сообщает, что в указанных условиях пептиды образуются с низкими выходами. Таким образом, специфичность этого метода не столь велика, как этого можно было бы ожидать на основании данных о выделении свободных аминокислот, и этот метод безусловно непригоден для селективного расщепления белков. [c.227]

Благодаря специфичности этих реакций изменение заряда касается только тех пептидов, которые имеют в своем составе определенную аминокислоту. Поэтому само явление изменения заряда можно использовать для выделения пептидов, содержащих соответствующие аминокислоты из такой многокомпонентной смеси, как ферментативный белковый гидролизат. [c.106]

Согласно изложенным выше представлениям, аминокислоты, отложившиеся на поверхности шаблона, образуют затем пептидную цепь. Этот процесс является ферментативным, однако нет никаких доказательств того, что в нем принимают участие специфические ферменты, и, следовательно, нет необходимости постулировать наличие таких специфических ферментов. Протеолитические ферменты, выделенные из органов, не являются специфическими, так как они катализируют гидролиз самых различных белков животного и растительного происхождения. Эти же ферменты могут катализировать и процесс синтеза пептидов из аминокислот, что было убедительно показано Бергманом и его сотрудниками [18, 20]. В предыдущих разделах данной главы уже указывалось, что синтез белков нельзя рассматривать просто как процесс, обратный их расщеплению, и что промежуточные реакции синтеза могут протекать иначе, чем соответствующие гидролитические реакции. Наиболее важным моментом является то, что мы не имеем решительно никаких доказательств специфичности ферментов, участвующих как в гидролизе, так и в синтезе белка. Специфичность образующегося белка можно вполне удовлетворительно объяснить специфической адсорбцией аминокислот на поверхности шаблона. [c.410]

Дальнейшие эксперименты показали, что, во всяком случае для нерва, на нервно-мышечном препарате специфична известная закономерность в распределении интенсивности излучения по его длине. Наблюдалась периодичность в распределении максимумов и минимумов излучения, выраженная особенно ясно при выделении отдельных спектральных слагаемых излучения, например гликолитической слагаемой, т. е. хемилюминесценции глюкозы, пептидной слагаемой — хемилюминесценции пептидов и т. д. Такая химическая характеристика спектра излучения нерва невозможная, как мы знаем, при работе с нервами и мышцами интактного организма, где спектральные полосы большей частью расширены, показывает, конечно, на отклонение субстрата от физиологического состояния, но она представляет вместе с тем интерес как показатель зависимости состояния субстрата от характера раздражений. Применение к седалищному нерву проприоцептивного раздражения (вытяжение мышцы), рефлекторного (фарадизация контралатерального нерва) и непосредственной фарадизации опытного нерва показало, что каждое из раздражений сопровождается специфичным для него распределением интенсивности излучения. [c.145]

Если определяемые аминокислоты расположены в активном центре или на поверхности белковой молекулы, успешно используется химическая модификация белков с последуюашм выделением меченых пептидов. Однако выделение пептидов, содержащих модифицированный остаток, достигается не легко главным образом потому, что модифицирующий реагент часто реагирует с другими остаткалш, давая продукты с различными выходами. По этой причине гидролизат белка содержит несколько модифицированных пептидов, каждый из которых присутствует в количествах, меньших эквимолярных по отношению к белку. Традиционные методы выделения пептидов включают трудоемкие и длительные операции, каждая стадия которых обычно значительно снижает конечный выход пептида. Использование аффинной хроматографии на сорбенте, специфичном к модифицирующему реагенту, позволяет в одну стадию выделить модифицированный пептид. Вилчек [62] различает три категории модификаций белков [c.126]

По длине пептидных цепей гормоны гипофиза значительно различаются между собой. Некоторые из них относятся к белкам среднего молекулярного веса. Например, гормон роста человека имеет мол. вес. 21 500 и характеризуется высокой специфичностью гормоны роста из других источников не могут его заменять. Гормон, стимулирующий функцию щитовидной железы (тиреотропии, ТТГ), представляет собой гликопротеид с мол. весом 28 000. С другой стороны, гормоны нейрогипофиза (задней доли гипофиза) вазопрессии и окситоцин являются простыми пептидами, построенными всего лишь из 9 аминокислотных остатков (собственно, из восьми, если считать цистин одной аминокислотой рис. 2-2). Как указывает уже само название, нейрогипофиз состоит из нервной ткани, секреторная функция которой находится под непосредственным контролем центральной нервной системы. Вазопрессии является основным фактором, регулирующим объем циркулирующей крови и артериальное давление на уровень секреции этого гормона оказывает влияние стресс. Окситоцин действует на гладкие мышцы матки при родах, а также служит триггером лактации. Выделение молока из молочных желез в определенной мере зависит от сосательных движений младенца, под влиянием которых происходит рефлекторное высвобождение окситоцина в кровоток. [c.321]

Образующееся соед. П имеет фйолетово-синюю окраску (>. 570 нм). Пролин и гидроксипролин, у к-рых нет а-аминогруппы, в р-ции с нингидрином образуют производное желтого цвета 440 нм). И. р. неспецифична, т. к. окрашенный продукт с нингидршюм дают также NH3 и др. соед., содержащие аминогруппу (в т. ч. белки и пептиды). Однако р-ции с этими соед. осуществляются без выделения СО2 (Н.р. с выделением СО2 специфична только для а-аминокислот). [c.248]

Протеиназы выспшх растений. Протеиназы, выделенные из растительных клеток, в больщинстве случаев относятся к сульфгидрильному типу, активируются цистеином, глутатионом и другими восстановителями. Оптимальная зона их действия находится при слабокислом, нейтральном и слабощелочном значениях pH и во многом зависит от природы субстрата. Типичный представитель — папаин из сока плодов дынного дерева ari a papaya). Папаин проявляет широкую субстратную специфичность — катализирует гидролиз пептидов, амидов, эфиров и тиоэфиров. Значительно реже встречаются растительные протеиназы, не активируемые восстановителями. Протеиназы насекомоядных растений, например росянки, имеют резко кислый оптимум pH (3—3,5). [c.370]

В случае аффинной хромографии выделение пептидов осуществляется в результате специфического и обратимого связывания с сорбентом. Благодаря этому пептиды можно концентрировать из большого объема, многократно использовать колонку, наконец, проводить весь эксперимент в течение короткого времени. Конечно, предварительно надо потратить усилия на синтез сорбента, однако благодаря высокой специфичности и несложной технике эксперимента эти усилия оказываются вполне оправданными. Поскольку методы синтеза аффинных сорбентов рассмотрены в гл. 13, в данном разделе будут приведены отдельные примеры, которые хорошо демонстрируют возможности метода. [c.415]

Области применения аффинной хроматографии расширяются, поокольку метод основан на специфических взаимодействиях биологически активных веществ. Как видно из табл. 11.1, этот метод успешно используется при выделении самых разных соединений. Наряду с этим он полезен при изучении различных систем на аффинных сорбентах можно разделять низкомолекулярные энан-тиомеры и удалять нежелательные вещества из живых организмов. -Например, аффинной хроматографией можно разделить на оптические антиподы 0,Ь-триптофан. Используя специфическое выделение меченых пептидов, можно определить пептиды активного центра фермента, связывающего участка антител или участка пептидных цепей на поверхности молекулы. Аффинная хроматография может быть использована для изучения возможности замены природных пептидных цепей ферментов различными модифицированными синтетическими пептидами. Активные центры ферментов или антител, связывающие свойства субъединиц, специфичность ферментов по отношению к различным ингибиторам, комплементарность нуклеиновых кислот, взаимодействие нуклеотидов с пептидами, влияние присутствия различных соединений на образование специфических комплексов и т. д. могут быть исследованы с помощью аффинной хроматографии. [c.282]

Гидролиз белков и пептидов. Этот тип состоит в разрыве пептидной (кислотоамидной) связи с образованием свободных аминной и карбоксильной групп. Его осуществляет громадное число микроорганизмов или выделенных из них ферментов. Процесс очень сложен и тесно связан со специфичностью применяемых биокатализаторов получаемые продукты разнохарактерны и определяются главным образом первичной структурой расщепляемых белков или пептидов. [c.110]

Частичный и полный гидролиз белка был обсужден в статье II. Для полного гидролиза белка широко применяется метод, рекомендованный Чибнэллом и его сотрудниками (см. [3]). Следует применять такие методы гидролиза, . при которых аминокислоты не разлагаются ни на стадии образования пептидов, ни после выделения в свободном состоянии. Кроме того, в случае использования методов, специфичных по отношению к оптическим изомерам, необходимо по возможности предотвращать рацемизацию в процессе гидролиза. [c.212]

Высокоспецифическая сорбция белков биосорбентами зависит от объемной концентрации карбоксильных групп в ионите (рис. 6) и от pH раствора. Специфичность обусловлена строением биосорбентов, но регулируется и условиями проведения фронтальных сорбционных и десорбционных процессов. На биосорбенгах биокарб можно осуществлять не только разделение белков близкой молекулярной массы и с близкими изоточками, как, например, протеазы и амилазы (ММ 28 ООО и 30 ООО, р/ 4,8 и 4,6), но также и одноактное выделение с получением высокоочищенных препаратов из культуральной жидкости и экстрактов протеолитических и амилолитических ферментов, ацетилхолинэстеразы, нейрамини-дазы, урокиназы, иммуностимулятора тималина, нейрогормонов, а также других белков и пептидов. [c.134]

Наиболее детально исследована специфичность регуляторных пептидов, вызывающих высвобождение гистамина из тучных клеток кишечника (1а5аш е1 а1., 1979). Сравнение активности пептидов в широком диапазоне размеров и вариаций аминокислотных последовательностей (в том числе различных фрагментов АКТГ) с активностью дегранулирующего пептида показало только, что для проявления активности необходимо присутствие в цепи блока с четырьмя щелочными аминокислотными остатками и амидированного С-конца пептида. Но все варианты были на 2—4 порядка менее активны, чем природный дефанулятор. Иными словами, широкий спектр регуляторных пептидов может стимулировать выделение гистамина из тучных клеток, но каждый из них действует только в определенном диапазоне конценфаций. [c.126]

Снижение или полную отмену побочных эффектов при вакцинации связывают с получением вакцин нового поколения. Наметилось несколько технологических подходов к разработке таких вакцин. Один из них состоит в выделении из массы отдельных антигенов инфекционных микроорганизмов тех, которые обладают наибольшим протективным эффектом, т.е. инициируют наибольшее количество соответствующих по специфичности антител или обеспечивают преимущественный рост клона специфических Т-лимфоцитов. Однако подобная процедура приводит к снижению иммуногенности вьщеленных антигенов. Задача состоит в получении такого вакцинного материала, который, с одной стороны, сохранял бы узкую, наиболее характерную антигенную специфичность патогена, а с другой — был бы достаточно иммуногенен для инициации сильного протективного иммунитета. В качестве носителей с адъювантным эффектом для белковых антигенов или пептидов используют иммунологически инертные полимерные молекулы Ь-аминокислот (например, Ь-лизин), химических соединений, а также липиды, организованные в гранулы (липосомы), внутри котсфых содержится антиген. [c.340]

Для того, чтобы выделить из клонотеки пептиды с искомой биологической активностью, применяют различные методы скрининга. В частности, для выделения пептидов, имитирующих определенные эпитопы, используют биотинилированные моноклональные антитела (mAb) соответствующей специфичности, которые иммобилизуют на твердой подложке с помощью стрептавидина (рис. 47). Фаговые частицы, экспрессирующие на своей поверхности соответствующие эпитопы, взаимодействуют с антителами и задерживаются подложкой, тогда как другие рекомбинантные фаговые частицы удаляются в процессе промывания. Задержанные на подложке фаговые частицы элюируют буфером с низкими значениями pH, индивидуальные клоны дополнительно размножают в бактериальных клетках, и экспрессированные на них эпитопы исследуют по различным критериям. Наличие идентичных или сходных последовательностей нуклеотидов среди клонированных последовательностей свидетельствует о специфичности процесса очистки. Индивидуальные клоны затем охарактеризовывают другими, в частности иммуноферментными методами. На заключительной стадии осуществляют синтез выделенных пептидов и их всестороннее изучение в очищенном состоянии. [c.342]

Одним из таких подходов, имеющих прямое отношение к обсуждаемой теме, является отбор белковых лигандов фагового дисплея непосредственно в живом организме [100, 101]. В этом случае суспензию фаговых частиц дисплея вводят в кровоток экспериментального животного, через некоторое время животное забивают и из исследуемого органа выделяют находящиеся там фаговые частицы. Выделенные фаги размножают в бактериальных клетках и проводят новый раунд отбора. После нескольких раундов удается выделять фаговые частицы, специфически задерживаемые данным органом, а следовательно, экспрессирующие на своей поверхности лиганды, специфичные в отношении рецепторов органа (или ткани). При этом остальные органы и ткани организма осуществляют отрицательный отбор тех фаговых частиц, которые экспрессируют лиганды универсальной специфичности и взаимодействуют со всеми органами и тканями организма. С использованием такой системы отбора пептидов фагового дисплея удалось получить пептидные аптамеры, специфически взаимодействующие с многими тканями экспериментальных животных [102-105], в том числе с клетками гладких мышц мышей в области рестеноза [106], а также эпителием атеросклеротических сосудов [107]. [c.348]

В. Специфичность связывания малых пептидов открывает возможность использования аффинной хроматографии для выделения рецептора фибронектина, и эта стратегия была успешно применена. Сначала пептид, содержащий связывающую рецептор последовательность RGD, сорбировали на матриксе колонки, в данном случае на сефарозе. Затем через колонки пропускали растворенные детергентами белки плазматической мембраны, соблюдая условия, способствующие взаимодействию между рецептором и фибронектином. Далее колонку тщательно промывали для удаления несвязанных белков. Наконец, рецептор снимали с колонки, добавляя к отмывающему буферу пептид GRGDSP. При этом элюировался единственный белок с мол. массой 140 кДа. (Если использовали GRGESP, этого не происходило.) [c.496]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология