Нингидрин лизина

После окончания разделения хроматограмму высушивают на воздухе и проявляют раствором нингидрина путем опрыскивания из пульверизатора. З-атем нагревают 15—20 мин при 60° С в термостате или сушильном шкафу. Расположение аминокислот сверху вниз по направлению движения растворителя следующее цистин, лизин, аргинин, гистидин, аспарагиновая кислота, серии (три последние аминокислоты располагаются в виде тесно сближенных пятен) глутаминовая кислота, треонин, аланин, пролин, тирозин, валин, метионин, триптофан, фенилаланин, лейцин, изолейцин (последние три аминокислоты также часто располагаются в виде тесно сближенных пятен). [c.301]

После проявления нингидрином полосу хроматограммы, соответствующую каждой из аминокислот (в кислой системе растворителей — растворы № 1 или № 2 — лучше других разделяются пятна лизина, аргинина и валина), вырезают и сканируют на денситометре при 510 нм. Результаты сканирования оценивают либо по площадям полученных пиков, которые рассчитывают путем умножения высоты пика на его ширину на уровне половины высоты, либо по массам пиков. Для этого пики переводят на кальку. Пики на кальке вырезают и взвешивают. По этим данным строят калибровочный график зависимости площади пика (или его массы) от содержания аминокислоты (в микромолях). [c.137]

ДНФ-аргинин и е-ДНФ-лизин разделяются не полностью, удается обнаружить оба соединения, используя различное поведение при реакции с нингидрином. ДНФ-цистеиновая кислота и моно-ДНФ-цистин никогда не встречаются вместе. Важно удалить избыточную кислоту после нанесения раствора, для чего пластинку следует нагреть в токе воздуха в течение 10 мин при температуре около 60°. Затем ее 15 мин охлаждают. [c.418]

Наиболее общим методом определения концентрации пептидов является колориметрия продуктов реакции с нингидрином [2]. Это один из наиболее чувствительных колориметрических методов. Для обнаружения аминокислот и пептидов разработаны как обычный, так и полностью автоматизированный варианты, причем нингидриновый реагент не вызывает коррозии и его можно подавать обычным микронасосом. Реакция идет по свободным аминогруппам, но в некоторых случаях хромофор образуется с низким выходом. Данные по окрашиванию дипептидов можно найти в работе [3]. У всех дипептидов, содержащих в качестве Ы-концевой аминокислоты аргинин, треонин, серин, глутаминовую кислоту, глицин, фенилаланин, метионин, лейцин и тирозин, интенсивность окраски составляет 1,6-10 у лейцина эта величина составляет 1,7-10 . У дипептидов с М-концевым лизином и аспарагиновой кислотой интенсивность окраски несколько выше (на 20 и 29% соответственно), а дипептиды с Ы-концевым гистидином и триптофаном проявляются несколько слабее (42 и 67% соответственно от средней интенсивности). Дипептиды с М-концевым пролином, валином и изолейцином окрашиваются очень слабо [2,7 6,4 и 8,5% от средней (1,6- 10 ) интенсивности]. [c.391]

Смешивают 1 мл раствора, содержащего 0,02—0,4 мг а-аминокислоты [127], с 0,5 мл буферного раствора (рН = 5,3— 5,4) и 0,5 мл 3%-ного раствора нингидрина в метилцеллозольве. Нагревают 15 мин при 100 С, после чего добавляют 5 мл 50%-ного изопропилового спирта и взбалтывают. После охлаждения до комнатной температуры измеряют оптическую плотность красного раствора при 570 нм. Таким способом определяют аланин, аспарагиновую кислоту, аспарагин, валин, глицин, глутамин, глутаминовую кислоту, гистидин, изолейцин, лизин, метионин, орнитин, серии, таурин, тирозин, треонин, фенилаланин, этаноламин, а также аммиак. При определении пролина и оксипролина получают раствор, оптическую плотность которого измеряют при 440 нм. [c.169]

Азот лизина = 2 X (аминный азот— карбоксильный азот ), где аминный азот определяется по реакции с азотистой кислотой, а карбоксильный азот определяется по реакции с нингидрином. [c.59]

После окончания разделения хроматограмму высушивают на воздухе и проявляют, для этого ее опрыскивают из пульверизатора 0,2%-ным раствором нингидрина в ацетоне. Затем нагревают 15—20 мин при 60 °С в термостате или сушильном шкафу. Расположение аминокислот сверху вниз по направлению движения растворителя следующее цистин, лизин, аргинин, гистидин, аспарагиновая кислота, серии (три последние аминокислоты располагаются в виде тесно сближенных пятен) глутаминовая кислота, треонин, аланин, пролин, тирозин, валин, метионин, триптофан, фенилаланин, лейцин, изолейцин (последние три аминокислоты также часто располагаются в виде тесно сближенных пятен). Для того чтобы сохранить пятна на хроматограмме, их фиксируют 1%-ным раствором нитрата меди в ацетоне, погружая хроматограмму в этот раствор или опрыскивая ее из пульверизатора. После фиксации пятна приобретают красно-оранжевую окраску. [c.331]

С помощью двумерного разделения было подтверждено присутствие лизина, гистидина, серина, глицина, аспарагиновой кислоты и треонина. В качестве элюентов последовательно использовали фенол, насыщенный водой, и систему бутанол — уксусная кислота вода. Метионин идентифицировали действием иодида платины, а валин — обработкой перекисью водорода после извлечения метионина. Остальные аминокислоты детектировали действием нингидрина. [c.563]

Определение начала или конца вымывания моноаминокислот или лизина производилось 5 каплями экстракта, 0,5 мл 1%-ного раствора нингидрина и 0,5 мл (М/З pH = 7) фосфатного буфера. [c.66]

Аргинин, гистидин, лизин определяют в элюате нингидринным методом или измененным по Сакагучи — Паули. Некоторые исследователи сообщают о возможности разделения дикарбоновых аминокислот на синтетических анионообменных смолах типа амберлита Ш-4 [46, 62, 68, 273 . [c.164]

Вопрос о том, одинаковы или различны аминокислотные последовательности субъединиц, можно выяснить путем определения числа пептидов в ферментативном гидролизате белка. Наиболее широко используемый для этой цели протеолитический фермент — трипсин, гидролизующий только те пептидные связи, которые образованы карбоксильными группами лизина или аргинина. По суммарному содержанию лизина и аргинина в белке можно примерно предсказать число триптических пептидов, которые должны образоваться при полном гидролизе трипсином. Для белка, состоящего из одной полипептидной цепи, число триптических пептидов равно числу остатков лизина и аргинина в молекуле плюс 1. Вдвое меньшее число пептидов образуется из белка, содержащего две субъединицы с одинаковой аминокислотной последовательностью. Пептиды разделяют на бумаге или других подходящих носителях (гл. 5), используя обычно электрофорез в одном направлении и хроматографию в другом с последующим обнаружением пептидов по реакции с нингидрином. Чрезвычайно маловероятно, чтобы два триптических пептида с различной аминокислотной последовательностью обнаружились в виде одного пятна. Более серьезные возможные осложнения обусловлены тем, что значительная часть триптических пептидов оказывается нерастворимой и не проявляется на пептидных картах, как это иногда случается при исследовании крупных белков. Обычно же число обнаруживаемых пептидов довольно близко к ожидаемому. Следовательно, метод пептидных карт в сочетании с определением молекулярной массы достаточен для того, чтобы выяснить, являются ли аминокислотные последовательности субъединиц одинаковыми или различными. [c.172]

В качестве свидетелей используют свободный ДНФ, а также мо-но- и ди-ДНФ-производные лизина. Эти соединения окрашены в желтый цвет и определение их локализации на хроматограмме не требует специальной обработки. Для обнаружения свободного лизина хроматограммы обрабатывают нингидрином (с. 129). В указанных условиях хроматографирования свободный лизин располагается вблизи линии старта, далее в порядке удаления от нее следуют моно-ДНФ-про-изводное лизина (е-ЫНг-ДНФ-лизин), имеющее после обработки нингидрином буро-коричневое окрашивание, свободный ДНФ и ди-ДНФ-производное лизина. Для количественного определения моно- и ди-ДНФ-производных лизина соответствующие участки хроматограммы вырезают, элюируют 1%-ным раствором ЫаНСОз и измеряют оптическую плотность элюатов при 360 нм. [c.148]

Принцип метода. Нингидрин дает цветную реакцию с концевыми a-NH2-rpynnaMH белков, а также с e-NH2-группами остатков лизина. [c.69]

Эти фракции хроматографировали на бумаге. В предварительном опыте обнаружено, что 1 при проявлении нингидрином дает несколько пятен у старта, плотно прилегающих друг к другу. У П проявляется только одно слабое пятно с 0.10 (нингидрин). Остальные фракции сопоставлены с деацетилколхицидил- , -лизином, неразделенным гидролизатом и исходным белковым осадком. Во фракции П ( рис. 5.2) обнаружено флюоресцирующее пятно оранжевого [c.265]

Основы метода. Все встречающиеся в природе я-аминокис-лоты, за исключением гликоколя, дезаминируются и декарбо-ксилируются при нагревании с водным раствором нингидрина. (трикетогидринденгидрата) (Руэман [559]) в разбавленной кислоте при этом образуются NHa, СО2 и соответствующий низший альдегид. Этой реакцией воспользовались Ван-Сляйк и др. [636, 637, 638] для определения лизина в осадке фосфорновольфрамовой кислоты (см. гл. I) также для определения глютаминовой и аспарагиновой кислот в смесях (см. гл. VI) Виртанен н др. [662, 663] использовали эту реакцию для определения аланина (см. гл. VII). [c.355]

Описано влияние витамина Ве на аминокислоты у пациентов, страдающих детской пеллагрой (Квашиоркор) [65]. В моче больных, страдающих псориазом, определено 27 аминокислот и других нингидрин-положительных соединений [66]. Выделение аминокислот во время беременности исследовали Армстронг и Яте [67] они установили, что количество треонина было увеличено в три раза, количество выделявшегося таурина увеличивалось ежедневно вплоть до восьми недель, а уровень содержания мочевины и этаноламина оставался без изменений. Позднее Браун [68] опубликовал данные по изучению аминоацидурий. Повышенное содержание цистина, орнитина, аргинина и лизина наблюдали тогда, когда раковым больным прописывали циклолейцин. Определялся почечный клиренс свободных аминокислот у подростков с помощью ускоренного метода хроматографии [c.10]

Тролл и Каннан [112] установили, что органические растворители — диоксан, этанол, метилцеллозольв, пиридин и фенол — ускоряют развитие окраски в различной степени. При комнатной температуре теоретический выход дают десять из всех обычных аминокислот. При 100 °С все аминокислоты, за исключением триптофана и лизина, реагируют количественно. Фенол (80%) в абсолютном этаноле и КСМ-пиридиновый реагент используются как наиболее эффективные растворители для нингидрин — гид-риндантиновой реакционной смеси. Другие аномальные реакции нингидрина описаны Шиллингом с сотр. [ИЗ]. [c.25]

В одном из исследований было найдено, что включение аминокислот в дезоксирибонуклеогистоны зависит от продолжительности инкубирования, pH и концентрации аминокислот [622]. Включенные аминокислоты были прочно связаны, и карбоксил аминокислот не освобождался при действии нингидрина. Это включение, которое, возможно, не было обусловлено образованием пептидных связей, усиливалось при повышении температуры до 100°. Другой необычный тип включения наблюдали в опытах с лизином [623, 624, 714], который, по-видимому, образует связи с белком через е-аминогруппы. [c.277]

Реакция дезаминирования азотистой кислотой лежит в основе общеизвестного метода определения аминогрупп по Ван-Сляйку он описан выше. Если соответствующим образом учитывать ограничения этого стандартного метода и тщательно контролировать условия реакции, то он окажется наиболее удобным способом определения количества свободных аминогрупп в белках. Легче всего реагируют концевые, а-аминогруппы, несколько медленнее—е. -аминогруппы и уже весьма постепенно выделяют азот гуанидинные группы. Тот факт, что количество свободных аминогрупп, определенных по методу Ван-Сляйка, превосходит содержание лизина, рассчитанное на основании аналитических данных, является первым доказательством наличия М-концевых групп в белках. Реакция с азотистой кислотой протекает быстро и количественно она нашла широкое применение для определения степени замещения аминогрупп в модифицированных белках. В последнее время предпочтение стали отдавать нингидринному методу. [c.313]

Дженкинсон и Тинслей [19] идентифицировали с помощью хроматографии на бумаге состав аминокислот, гидролизат которых был получен в ходе изучения аминокислот растительного происхождения, выделенных из компоста. Десять мл гидролизата, содержавшего приблизительно 1 мг связанного азота, запаривали досуха при пониженном давлении, растворяли в 5 мл воды и снова упаривали досуха. Остаток растворяли в 1,5 мл воды и центрифугировали. Осветвленную жидкость в количестве 0,04 мл наносили на бумагу Ватман № 1. Разделение проводили элюентом, предложенным Вольфом [20]. Хроматограмму проявляли, окуная лист в 0,2%-ный раствор нингидрина в ацетоне. Были идентифицированы следующие аминокислоты цистеиновая, аспарагиновая, глутаминовая, лизин, аргинин, глицин, гистидин, серии, аланин, тирозин, пролин, валин, треонин, изолейцин, лейцин и фенилаланин. Метионин не поддавался определению, поскольку его трудно было отделить от глицина в описанных системах растворителей. Метио-нин-5-оксид тоже не отделялся от валина. Хроматограммы опускали в 0,1%-ный раствор изатина в ацетоне для обнаружения про-лина и подтверждения отсутствия оксипролина. Детектирование и определение содержания пептида с остатком лизина в середине цепи проводили с помощью 2,4-динитрофторбензола [21]. Эта реакция протекает, поскольку е-аминогруппа, в отличие от а-амино-группы лизина, свободна и может вступать в реакцию. [c.306]

Иемм и Кокинг [98] разработали упрощенную методику, по которой смешивают 0,5 мл 0,2 М цитратного буфера с pH 5, 1,2 мл раствора нингидрина и цианистого калия в метилцеллозольве VI 1 мл фракции аминокислоты, после чего нагревают 15 мин при 100°. Сообщается, что нингидриновый реагент устойчив в течение недели, а интенсивность окраски сохраняется в течение 3 час перед разбавлением или в течение 1 час после разбавления смесью спирт — вода (60 40). Большинство аминокислот дает теоретический выход ДИДА исключение составляют лизин (108%), фенилаланин и тирозин (89%), триптофан (83%) и аммиак (33%). Пониженная чувствительность к аммиаку (но сравнению с реагентами, содержащими хлористое олово) неожиданна в свете повышенных выходов ДИДА для большинства аминокислот. Для оиределения самих аминокислот, однако, это является преимуществом, так как приводит к меньшим и лучше воспроизводимым значениям оптической плотности растворов сравнения. Реагент, содержащий цианид, позволяет также уменьшить время, менее строго выдерживать условия нагревания и экономить нингидрин, который не нужно хранить в атмосфере азота [98]. [c.146]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология