Полипептиды дейтерирование

При растворении простых пептидов или белков в окиси дейтерия атомы водорода, соединенные с азотом, кислородом или серой, замещаются на дейтерий. При контакте дейтерированного продукта с обычной водой дейтериевые атомы снова замещаются на атомы водорода. У простых пептидов этот обмен протекает наиболее полно и быстро, практически мгновенно. Однако у разных белков и полипептидов скорости обмена сравнительно малы, а степень обмена при установлении равновесия значительно менее 100%. Количественные исследования этой реакции, проведенные с использованием разнообразных химических и физических методов, в том числе инфракрасной спектроскопии и ядерного магнитного резонанса, внесли важный вклад в дело выяснения вторичной структуры белков. Действительно, из полученных результатов были сделаны принципиальные выводы, так как было найдено, что атомы водорода и дейтерия, соединенные с атомами азота пептидных групп, образующих водородные связи, обмениваются гораздо медленней, чем подобные атомы, не участвующие в образовании водородных связей (и, следовательно, более доступные растворителю), или атомы, входящие в состав функциональных групп боковой цепи. В молекуле белка, как оказалось, могут содержаться и другие медленно обменивающиеся атомы водорода в их число входят атомы, экранированные гидрофобными участками молекулы, а также атомы пептидных связей, отличающихся большими пространственными [c.391]

ИЛИ совсем не обмениваться. В тех случаях, когда атомы водорода участвуют в водородных связях или находятся в гидрофобных областях вне контакта с растворителем, их нормальная скорость Обмена снижается. Для определения скорости обмена дейтерированный белок растворяют в Н2О и через определенные интервалы времени измеряют плотность растворителя, которая зависит от относительного содержания дейтерия. Можно также использовать в подобных экспериментах радиоактивный тритий или определять скорость обмена по уменьшению интенсивности амидной полосы поглощения в инфракрасной области при 1550 м , которое наблюдается при растворении белка в D2O. Последний способ является наиболее удобным. Определение скорости изотопного обмена можно производить и по другим полосам поглощения в инфракрасной области, а также с помощью магнитного ядерного резонанса. В случае малых полипептидов для этой цели можно использовать спектры комбинационного рассеяния. Следует учесть, что эти методы приводят к правильному результату только в тех случаях, когда изотопное замещение не вызывает изменения конформации белка. Например, для нормальной рибонуклеазы температура перехода в воде при pH 4,3 равна 62°, а для дейтерированной, растворенной в D2O, она равна 66°. Таким образом, дейтерирование способствует сохранению спиральной конформации. Поэтому при анализе экспериментов по изотопному обмену, проводимых при 65°, необходимо учитывать изменение относительного содержания фракций белка, имеющих различную конформацию. Во избежание подобных осложнений следует проводить опыты в условиях, исключающих возможность конформационных переходов. [c.295]

Проведены исследования дихроизма полос поглощения, лежащих в ближней ИК-области спектров двуосноориентированных пленок полиамида, полиэтилена, поливинилового спирта, поливинилхлорида и. ноливинилиденхлорида [516, 518]. Таким способом определяли ориентацию осей зигзагообразных метиленовых цепочек и различных химических групп. Исследования натуральных и синтетических бел Ков и полипептидов в ближней ИК-области в поляризованном свете проведены в [387, 488, 489, 624]. а- и р-Кератин можно различить на основании дихроичного поведения не.которых полос. Получены спектры различных структурных модификаций поликапроамида и N-дейтерированного полимера в области от 4000 до 6000 см [769]. Проведена также интерпретация полос. По спектрам в ближней ИК-области было показано [393], что все ОН-группы в целлюлозе связаны водородными связями. В работах [81, 1069] дана интерпретация спектров в области от 4000 до 8000 см различных материалов на основе целлюлозы. Даны объяснения обертоновых и комбинационных тонов в спектре. Выводы проверяли по данным анализа спектров дейтерированных образцов. Было также обнаружено, что дихроизм всех полос очень незначителен. При исследовании сополимеров этилена и пропилена было показано [1748], что обертоновое колебание (5800 см ) валентного колебания СНг-группы состоит из двух компонент, относительная интенсивность которых зависит от длин метиленовых блоков в сополимере. Оказалось, что смещение максимума полосы поглощения от 5780 (в чистом полиэтилене) к 5800 см- (в чистом полипропилене) зависит от состава сополимера. Анализ сополимеров этилена с пропиленом в ближней ИК-области проведен также в [1709]. [c.183]

Сообщается о применении дейтерообмена для анализа структуры белков [846]. Ранее были определены константы скорости обменных реакций и степени дейтерирования некоторых белков по полосам комбинационного тона, лежащем в ближней ИК-области (4590 и 4870 см- ) [460, 461]. Оказалось, что в а-кератине при 30°С обменивается около 30% подвижных водородных атомов. Эта величина не возрастает и после очень длительного дейтерирования. Однако с ростом температуры или величины рВ она повышается. Для многих белков не удается объяснить частичное дейтерирование непроницаемостью кристаллитов для воды, так как кристаллиты связывают воду с образованием гидратов. В этом случае непроницаемость связана со стереохимической структурой полипептид-ной цепи. [c.117]

Баллард, Бамфорд и Эллиотт [409] исследовали процесс дейтерирования ХН-грунны трех полипептидов поли- у-бензил- -глутамата, полп- -бен- [c.353]

По Фрейзеру и Прайсу, пептидная группа рассматривается в первом приближении как нелинейная трехатомная молекула, в которой валентные колебания могут происходить в фазе и не в фазе, как это показано на рис. 12. Так называемая карбонильная частота — 1660 см , высшая по значению, соответствует колебаниям не в фазе, и очевидно, что момент перехода должен при этом отклоняться к связи N. Колебания в фазе имеют частоту, совпадающую с частотой плоскостных деформационных колебаний NH, с которыми они и взаимодействуют, давая две новые частоты, одну около 1550 см и другую около 1270 см . Соответствующие полосы хорошо известны в спектрах полипептидов и белков. Доказательство правильности такой интерпретации можно получить, дейтерируя группу NH. Ленор-ман [84, 85] нашел, что в этом случае полоса 1560 м исчезает, а появляется новая полоса около 1460 о которая и соответствует валентным колебаниям в фазе пептидной группы, так как при дейтерировании полоса деформа- [c.316]

Дейтерообмен водородных атомов, участвующих в водородной связи, приводит зачастую к более сложным эффектам, чем просто снижение частоты в У2 раз, что обычно наблюдается для валентных колебаний ХН-группы. Причина состоит в том, что в результате изменений частоты колебаний ХН-группы уменьшается их взаимодействие с другими колебаниями, а также и резонанс Ферми. Изотопный обмен сильно сказывается и на туннельном эффекте, поскольку имеется частотная зависимость между массами туннелируемых атомов. Он проявляется в уменьшении расщеплений термов [1910]. Полосы v(XD) водородных связей обычно уже v(XH)-полос. При дейтерировании полиамидов и полипептидов наблюдается появление двух полос при 2470 и 2420 см вместо полосы 3300 см . Эти полосы более узкие. Соотношение их интенсивностей связано со степенью упорядоченности полимера. Однако ни одну из полос не удается отнести к определенной фазе [99, 260]. Ряд авторов [94, 219, 479] объясняет появление этого дублета резонансом Ферми колебания v(ND) с комбинационным колебанием. [c.137]

Интересно, что все полиамиды, полипептиды и белки имеют одинаковый характер спектра колебаний группы НН интенсивная полоса около 3300—3350 и слабый сателлит около 3080—ЗЮОсл (см. рис. 1, г). Эти полосы поляризованы вдоль направления Н—Н---0=С и появляются при дейтерировании вблизи 2470 и 2420 см . При понижении температуры поведение их аналогично поведению соответствующих полос Н-метилацетамида, однако эффект выражен слабее. Было показано, что изменение степени кристалличности полимера несколько влияет на отношение интенсивностей компонент дублета [172], но ни одна из них в отдельности не может быть приписана какой-либо фазе. [c.311]

Недавние исследования мономолекулярных слоев полимеров способствовали получению данных о стереохимической конформации и конфигурации макромолекул. Так, Малкольм [631 уточнил вопрос о преимущественной конформации полипептидов в мономолекулярных слоях, расположенных на поверхности воды. До этого считалось, что макромолекулы имеют вытянутую форму аналогично мономолекулярным слоям на границе раздела фаз вода — воздух. Известно, что N-дейтерированные полипептиды легко вступают в реакцию обмена с водородом в том случае, если они находятся в растворе или способны к образованию водородных связей с растворителем. С другой стороны, скорость реакции обмена мала, когда полипептид свернут в спираль. Основываясь на этом положении, были исследованы мономолекулярные слои в растворе 0,01 н. НС1 дейтерированных полипептидов полимеров D-a-амино-н-масляной кислоты, 0,Ь-лейцина, у-метил-Ь-глутамата, у-этил-Ь-глутамата и у-бензил-Ь-глутамата. После выдерживания на поверхности в течение 10 мин мономолекулярные слои исследовали методом ИК-спектроскопии. Во всех случаях дейтерообмен почти не происходил н спектры были идентичны спектрам макромолекул, имеющих форму а-спиралей. Дейтерообмен возрастал при повышении температуры и pH среды. Одновременно наблюдался переход макромолекул в -спирали. В дополнение к сказанному необходимо отметить, что площади удельных поверхностей (области экстраполяции), полученные для полимера в растворе 0,01 н. НС1, находятся в хорошем согласии с минимальными величинами, рассчитанными по данным рентгенографии для отдельных полимеров, имеющих конформацию а-спиралей. [c.548]

Рис. 213. Скорость дейтерирования КН-группы полипептидов, определенная по изменению оптической плотности поглощения NH-гpyппы.

В качестве примера такого эффекта можно привести реакцию дейтерирования некоторых полиаминокислот, изученную Линдер-штремом и Хвидт [30]. Было обнаружено, что скорость изотопного замеш,ения атомов водорода для некоторых белков замедлена, если последние находятся в форме а-спирали или каким-либо другим образом образуются устойчивые водородные связи. При переходе к конформации свернутого клубка дейтерирование характеризуется обычно большей скоростью. Скорость изотопного обмена для полипептидов может служить фактически мерой скорости перехода одной конформации макромолекулы в растворе к другой. [c.269]

Вторичная или третичная структура белка может оказывать большое влияние на ту легкость, с которой реакционноснособные атомы водорода могут принимать участие в изотопном обмене. Использование таких эффектов для исследования строения белка было впервые осуш ествлено в Карлсбергской лаборатории в Копенгагене, в частности Линдерштром-Лангом, который разработал изяш ный метод наблюдения за процессом обмена. Согласно этой процедуре, белок вначале обрабатывался при повышенной температуре ВгО с целью замеш ения атомов водорода пептидных звеньев, а также активных атомов водорода белковых цепей (—СООН, —КНг, —ОН, —ЗН и т. д.) дейтерием. Дейтерированный белок затем растворяли в воде, через установленные промежутки времени отбирали пробы раствора, которые замораживали при —60° для прекраш ения реакции обмена и подвергали сублимации под высоким вакуумом. Затем с помош ью метода седиментации в градиенте плотности определяли плотность воды в сублимате [1036]. Недавно был разработан другой экспериментальный метод, который основан на исчезновении полосы инфракрасного поглощения при 1550 см при дейтерировании полипептидов или белков [1037, 1038]. Преимущество этого метода заключается в том, что он может быть приспособлен к сравнительно быстрым скоростям реакции с использованием аппаратуры для остановки реакции. Он отличается от метода седиментации в градиенте плотности тем, что в нем измеряется лишь изотопный обмен атомов водорода в пептидных группах. [c.348]