Двойная иммобилизация

Она широко используется как носитель для иммобилизации. Однако стоимость агарозы довольна высока, поэтому разрабатываются различные методы ее модификации с целью получения легко регенерируемых форм. При охлаждении горячего 2—6%-ного водного раствора агарозы до температуры ниже 45°С образуются прочные крупнопористые гели, представляющие собой сложную смесь из заряженных и нейтральных полисахаридов. В процессе образования геля индивидуальные полисахаридные цепи образуют двойные спирали, которые далее агрегируют с образованием узлов . При температуре около 100°С гель агарозы плавится, поэтому в отличие от сефадексов его нельзя автоклавировать. Высушивание агарозы приводит к необратимой деструкции геля, поэтому его необходимо хранить в виде водной суспензии. [c.14]

Рис. 9. Иммобилизация ферментов с использованием полупроницаемых оболочек (мембран) а — микрокапсулирование б — двойное эмульгирование в — включение в волокна г — включение в полые волокна с полупроницаемыми стенками д — включение в липосомы точками обозначены молекулы фермента символами 5 и Р — субстрат и продукт ферментативной реакции соответствеино

Для многих применений важно привить различные органические группы, способные -к дальнейшим реакциям. Среди таких групп рассмотрим группы с концевыми двойными связями (алкенильные группы) и с концевой аминогруппой. Привитые алкенильные группы можно использовать в последующих реакциях, в частности, в реакциях сополимеризации с различными мономерами, а аминные группы — в реакциях, нанример, с диальдегидами, применяемыми для иммобилизации ферментов. [c.103]

Для определения величины константы скорости присоединения первичных радикальных продуктов распада инициатора (иммобилизации) по двойной связи мономера к,, , можно использовать предложенное Иван-чевым с сотрудниками [138] уравнение [c.53]

Эта периодичность близка к периодичности В-формы ДНК. Означает ли это, что повторяемость чувствительного сайта просто отражает иммобилизацию ДНК на гистоновом октамере Это может происходить так, как изображено на рис. 29.16, где пик чувствительных сайтов встречается в каждой цепи с периодичностью, определяемой числом пар оснований на виток двойной спирали. [c.367]

Мы считаем, что при иммобилизации ДНК на плоской поверхности периодичность разрезания (расстояние между точками расщепления) действительно соответствует структурной периодичности (число пар на виток двойной спирали). Вариации в периодичности разрезания ДНК минимальной нуклеосомы (10,0 на концах и 10,7 посередине) затрудняют интерпретацию этого явления. [c.367]

При иммобилизации методом двойного эмульгирования (Т. Чанг, 1965) сначала готовят эмульсию водного раствора фермента в органическом растворе полимера, точно так же, как было описано для случая получения микрокапсул первым способом. Готовую эмульсию вновь диспергируют, на этот раз в воде. В результате получается водная эмульсиая из капель органического раствора полимера, содержащих, в свою очередь, еще более мелкие включенные капли водного раствора фермента (рис. 9, б). Через некоторое время органический раствор затвердевает, образуя полимерные сферические частицы с иммобилизованным в них ферментом. [c.70]

Для иммобилизации ферментов в геле существует два основных способа. При одном из них фермент помещают в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате которой образуется полимерный гель с включенными в него молекулами фермента. В реакционную смесь часто добавляют также бифункциональные (т. е. содержащие в молекуле две двойные связи) сшивающие агенты, которые придают образующемуся полимеру структуру трехмерной сетки (рис. 7,с). [c.57]

Реакции как алкилирования, так и арилирования можно провести путем присоединения фермента (посредством его тиольных, амино- и гидроксильных групп) по активированным двойным связям. Для этой цели используют гидроксилсодержащие носители, предварительно активированные дивинилсульфоном или бензохиноном. Процесс иммобилизации можно представить, соответственно, схемами (14) и (15) [c.91]

С практической точки зрения удобен метод так называемой двойной иммобилизации, при котором в гель включается фермент, предварительно иммобилизованный путем адсорбции на твердом носителе, или же получение полимерного геля с включением фермента проводится в присутствии такого носителя. Приготовленный таким образом иммобилизованный препарат состоит из частиц твердого носителя, покрытых слоем ферментсодержащего геля. Метод двойной иммобилизации сочетает преимущества твердой матрицы (больщая удельная поверхность, механическая прочность, пористость, заданная текстура и форма частиц) и полимерных гелей. [c.66]

В работе [9] описана технология иммобилизации микроорганизмов на биосовместимых полимерах. Изучали фильтрующие свойства иммобилизованных дрожжей на альгинатных гелевых гранулах. Выявлено, что хорошие условия биоочистки сточных вод от органических зафязнителей могут быть созданы при применении иммобилизованны.ч дрожжей на Са-а. ыинатных гелевых фанулах с двойным слоем геля. [c.168]

Близким к инкапсулированию методом иммобилизации можно считать включение водных растворов ферментов в липосомы, представляющие собой сферические или ламеллярные системы двойных липидных бислоев. Впервые данный способ был применен для иммобилизации ферментов Дж. Вайсманом и Дж. Сессом в 1970 г. Для получения липосом из растворов липида (чаще всего лецитина) упаривают органический растворитель. Оставшуюся тонкую пленку липидов диспергируют в водном растворе, содержащем фермент. В процессе диспергирования происходит самосборка бислойных липидных структур липосомы, содержащих включенный раствор фермента. [c.90]

Для упорядоченного механизма иммобилизация лиганда А подвержена обычным ограничениям аффинной хроматографии. Б этом случае иммобилизация лиганда В не приводит к конкурентному сорбенту для комплементарной молекулы исключение составляют случаи, когда лиганд А присутствует в рабочем буферном растворе, в котором наносят фермент на колонку. Таким образом, присутствие лиганда А является необходимым для связывания сорбентом ферментов, поскольку лиганд В связывает двойной комплекс лиганд А — фермент. Это позволяет ввести в хроматографию предварительный отбор — из бирательное связывание, последующее элюирование достигается удалением лиганда А из рабочего буферного раствора. [c.110]

Для многих применений важно привить различные органические группы, способные к дальнейшим реакциям, например с концевыми двойными связями (алкенильные группы) и с концевой аминогруппой. Привитые алкенильные группы можно использовать в последующих реакциях сополимеризации с различными мономерами, а аминные группы — в реакциях, например, с диальдегидами для иммобилизации ферментов. Для иммобилизации ферментов широко используют неорганические носители, в частности кремнеземные, поверхность которых предварительно обрабатывают обычно 7-аминопропилтриэтоксисиланом (у-АПТЭС). В результате модифицирования этим реагентом поверхность кремнезема становится гидрофильной и приобретает основной характер. Для получения аминированных кремнеземных адсорбентов и носителей по этой реакции модифицирование проводят обычно в толуоле или в водном растворе. Реакцию модифицирования кремнезема у-аминопропилтриэтоксисиланом в безводном органическом растворителе (без добавления катализатора, поскольку имеются аминогруппы) можно представить следующей схемой [c.195]

Другой прием ретикуляции основан на использовании ферментов, предварительно ковалентно модифицироваиных реагентом, содержащим двойную связь, например акрилоилхлоридом. В этом случае при сополимеризации белкового макромономера с низкомолекулярными мономерами (например, с акриламидом) образуются сетчатые полимерные гели, сшитые белком или дополнительным сшивающим мономером (например, N. Ы-мети-лен-бис-акриламидом). В рассматриваемой системе исходное состояние — жидкий раствор, а конечное (после полимеризации) — твердое тeJ o (гель), причем, естественно, оно приобретает форму того сосуда (реактора), в котором проводится полимеризация. Целенакравлеиное использование этого явления положено в основу целого ряда оригинальных способов иммобилизации. Сшивкой белка в объеме растворителя (сополимеризацией) получают трехмерный гель (рис. 12, а) в виде крупного однородного блока, который можно механически измельчать и использовать в виде более или менее мелких частиц в суспензиях. Трехмерный гель можно готовить и непосредственно в виде мелких частиц сферической формы путем эмульсионной полимеризации. Эмульсии получают диспергированием водного раствора, содержащего мономеры, в несмешивающемся с водой органическом растворителе. Предельный вариант таких систем — микроэмульсии, или гидратированные обращенные мицеллы поверхностно-активных веществ (ПАВ) в органических растворителях. В мицеллярных системах размеры капелек , содержащих модифицированный фермент и мономеры, можно варьировать и даже получать их близкими к собственным размерам молекул ферментов. Это новое качество иммобилизации — молекулярный уровень. Иными словами, при использовании систем обращенных мицелл ПАВ в органических растворителях, можно обшивать отдельные молекулы фермента полимерной оболочкой заданной толщины, т. е. в полном смысле одеть фермент в рубашку, сшитую по мерке (рис. 12,6). [c.80]

В целом, введение аффинных меток в виде обсуждавшихся выше пептидных и полипептидных последовательностей существенно облегчает очистку меченых таким образом рекомбинантных белков, а также предоставляет дополнительные возможности наблюдать за эффективностью экспрессии рекомбинантных генов. Выбор для этих целей системы очистки зависит от конкретного белка, который предстоит получать в очищенном состоянии, а также от целей его дальнейшего использования. В ряде современных систем в рекомбинантные белки вводится двойная аффинная метка, одна из которых служит для очистки белка, а другая - для мониторинга за его биосинтезом. Также с помощью двойной метки может быть достигнута большая степень очистки рекомбинантных белков. Разработаны множественные аффинные аминокислотные последовательности, которые включают в себя кальмодулин-связывающий пептид, специфический сайт расщепления протеиназой и белок А для иммобилизации всей рекомбинантной конструкции. С помощью этих систем удается изучать белок-белковые взаимодействия путем выделения соответствующих белковых комплексов при исследованиях протеома [183, 184]. Методы иммобилизации белков с помощью аффинных последовательностей используются при создании пептидных и белковых микрочипов, клонотек на их основе, для адресной доставки белков и во многих других приложениях. О некоторых из них будет дополнительно рассказано в разделе П.3.2. [c.132]

Встречный электрофорез проводят в агаровом геле, pH которого устанавливают так, чтобы антитела (Ат) несли суммарный отрицательный заряд, а исследуемый антиген (Аг) - положительный. В электрическом поле антиген и антитела движутся навстречу друг другу и преципитируют. Принцип метода тот же самый, что и при двойной иммунодиффузии, однако чувствительность выше в 10 - 20 раз. Ракетный электрофорез позволяет количественно определять антиген в антителосодержащем геле, pH которого подбирают с таким расчетом, чтобы движения антител не происходило, а антиген нес суммарный отрицательный заряд. Линия преципитации очерчивает область в виде ракеты, длина которой пропорциональна концентрации антигена. Определить эту концентрацию можно по калибровочной кривой. Внизу справа - фотография окрашенного геля. Оба метода основаны на различии суммарных зарядов антигена и антител при выбранном pH для большинства антигенов такие различия существуют, так как антитела имеют более высокую изоэлектрическую точку (т. е. несут нейтральный заряд при более высоком значении pH, чем большинство антигенов). Если заряды антигена и антител существенно не различаются, можно химически модифицировать антиген, чтобы сдвинуть изоэлектрическую точку. Ракетный электрофорез проводят и в обратной постановке, если требуется определить концентрацию антител здесь важно подобрать правильно гель и pH для иммобилизации антигена, чтобы не нарушалась его структура и не возникло препятствий для реакции антиген-антитело. (Р - диаметр кольца преципитации.) [c.530]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология