Ферменты аналитические методы получения

Основное внимание в этой главе уделено методам получения крупных фрагментов белка и соответственно методам ограниченного гидролиза с использованием ферментов, обладающих высокой специфичностью. Использование таких методов играет существенную роль как в определении аминокислотной последовательности белков, так и в структурно-функциональных исследованиях. Наиболее специфические протеазы гидролизуют полипептидную цепь по основным аминокислотным остаткам — Lys и Arg или по кислотным — Glu. Другие ферменты обладают более широкой специфичностью к гидрофобным аминокислотным остаткам. Тем не менее такие ферменты нашли широкое применение при дополнительном гидролизе крупных фрагментов белка. В этой главе описаны также свойства протеазы, гидролизующей по остаткам пролина. Этот фермент представляет несомненный интерес, но в настоящее время еще не получил широкого применения. Следует надеяться, что возможности аналитической химии белка будут расширяться в дальнейшем благодаря выпуску новых коммерческих препаратов из числа описанных в этой главе и открытию новых высокоспецифичных ферментов. [c.160]

Трудности обычно возникают на стадиях 1, 2 и 6. Мы будем исходить из того, что стадия I осуществлена и выделен по крайней мере частично очищенный фермент. Чтобы вызвать у кролика образование большого количества антител, достаточно менее одного миллиграмма чистого фермента. Поддержание высокого титра антител в крови достигается повторными ежемесячными инъекциями по 0,1—0,3 мг фермента. Однако некоторые белки значительно более антигенны, чем другие, так что даже следы их примесей в препарате фермента, не определяемые обычными аналитическими методами (разд. 9.1), могут вызвать весьма интенсивное образование антител у кролика. Впоследствии эти антитела будут связываться со своими антигенами, присутствующими в больших количествах в неочищенных препаратах фермента. Таким образом, селективность полученных антител окажется значительно более низкой, чем ожидалось. Эта проблема приобретает особую остроту, если очищаемый фермент является относительно слабым антигеном. [c.174]

Для этого жидкую сыворотку замораживают в стеклянной чаш- ке и помещают в вакуум-эксикатор, который при помощи стеклян- ной трубки по возможности большого диаметра соединяют через охлаждаемую ловушку с масляным вакуум-насосом. В зависимости от вакуума, который должен достигать не менее 10 мм рт. ст., через несколько часов (или дней) сыворотка полностью высыхает. Активность полученного препар-ата перед использованием его для аналитических целей определяют любым стандартным методом, например электрометрическим ДрН-методом. Построение калибровочной кривой и само определение проводят с растворами ферментов равной активности. [c.174]

Ферменты растительного или животного происхождения постепенно заменяются на микробные ферменты. Биотехнологи и генные инженеры научились получать по заказу такие штаммы-мутанты, которые синтезируют необходимый фермент в десятки и сотни раз больших количествах, чем исходные штаммы. Понятно, насколько упрощается работа по получению и выделению ферментов из таких источников. Особо важную роль в расширении использования ферментативных методов анализа сыграло внедрение в аналитическую практику иммобилизованных ферментов. Методами инженерной энзимологии можно получать различные формы гетерогенных стабилизированных биокатализаторов, которые лишены многих недостатков, присущих растворимым ферментам. Иммобилизованные ферменты могут применяться многократно, обладают повышенной стабильностью и к тому же менее чувствительны к действию случайных примесей в анализируемых смесях. Иммобилизованные ферменты во многих случаях оказались более эффективными, чем химические реагенты. [c.87]

К. Гофманом, Е. Л. Смитом, В. дю Винье и Л. Зервасом использовал полученные таким образом пептиды для выяснения субстратной специфичности ферментов. Все же имевшиеся в этот период в распоряжении ученых методы синтеза не позволяли подойти к синтезу высших пептидов немалую роль играло и отсутствие эффективных аналитических методов контроля. [c.8]

Использование аналитического метода как средства для дифференциации белков и объяснения их свойств впервые было предложено, повидимому, Риттхаузеном [68] в 1872 г. Такой подход к проблеме не потерял своего значения и сейчас, что стало очевидным после высказанного Викери в 1946 г, следующего утверждения [69] В последние годы вновь возникло убеждение в том, что не только химические, но также и физические свойства, или по крайней мере, многие из них, можно рационально объяснить исходя из аминокислотного состава, если последний достаточно хорошо известен и может быть правильно интерпретирован . Однако адэкватная интерпретация до настоящего времени невозможна и это отмечается, например, в высказывании Бейли [70] Одна из наиболее обескураживающих особенностей определения аминокислотного состава белков заключается в том, что полученные результаты не позволяют делать каких-либо существенных выводов. В ограниченной степени они полезны для определения питательной ценности белка, но они совсем не могут объяснить истинной биологической функции, а именно почему один белок представляет собой фермент, второй — гормон, а третий — токсин . [c.229]

Классификация по природе процессов, используемых для получения аналитического сигнала. Тест-методы могут быть разделены на физические, химические, биохимические и биологические. Физических методов немного, и они не играют большой роли в практике химического анализа. Биохимические методы обычно основаны на использовании ферментов и иммуносистем. Выделенные природные ферменты, особенно иммобилизованные, в известной мере приобретают свойства химических реагентов, поэтому, несмотря на специфику ферментов как химических соединений (особенности происхождения, условия хранения, время сохранения активности), ферментные методы можно отнести к химическим. Иммунометоды больше тяготеют к биологическим методам. Биологические методы, базирующиеся на использовании микроорганизмов, органов, тканей и даже высокоорганизованных организмов и целых популяций, упомянуты только в разделе, посвященном определению суммарных показателей (биотесты). [c.211]

Изменения активности некоторых белков коррелируются, как правило, с изменениями ряда физических свойств. Так, изменение формы белковой молекулы можно установить по изменению некоторых гидродинамических характеристик (например, коэффициента трения, инкремента вязкости), по изменению светорассеяния, поверхностных свойств, диффузии через полупроницаемые мембраны и скорости седиментации [90]. Изменения термодинамических свойств (энтальпии и энтропии), объема, растворимости, оптического вращения, поглощения в инфракрасной области, дифракции электронов, а также некоторые другие характеристики, приведенные Каузманом [90], используются для Оцейки изменений формы белковых молекул. Большинство этих измерений было проведено па макромолекулах неизвестной структуры, для которых не была установлена последовательность аминокислотных остатков. В настоящее время благодаря усовершенствованию методов деградации белков, аналитического определения Концевых групп, методов разделения и идентификации отдельных фрагментов можно успешно изучать белки с молекулярным весом порядка 20 ООО. Хотя эта работа еще не достигла молекулярного уровня, тем не менее она дает возможность лучше использовать значения физических констант белковой молекулы известной структуры для объяснения механизма взаимодействия фермента с субстратом. Структура такого белка, как фиброин (белковое вещество натурального шелка), в настоящее время хорошо изучена благодаря сравнению рентгенограммы и ИК-спектров нативного волокна с рентгенограммами [35, 38, 108, 140] и ИК-спектрами [168] небольших фрагментов белка известной структуры, полученных при деградации, а также синтетитегаихпмшнептидо [c.386]

В настоящее время хроматография на целлюлозных ионитах вошла в число повседневных методов белковой химии. Она с успехом применяется как для аналитических, так и для препаративных целей. В ближайшем будущем она несомненно найдет применение и в производственном получении ряда белков. Общее количество работ, в которых использовались ионообменные целлюлозы, достигает нескольких сотен и непрерывно увеличивается. Мы рассмотрели только общие закономерности и привели иллюстрирующие их примеры. Некоторые теоретические соображения и ряд других примеров приведены в обзорах Николаева [58], Давидовой и Рачинского [64]. Хроматография ферментов рассмотрена в обзоре Турба [59].1 Подробные указания по подготовке колонок с целлюлозными ионитами и ио проведению на них хроматографии даны Петерсоном и Собером [60], Горяченковой [61] и Гинодманом [63]. [c.229]

Дальнейших успехов в химии гликонротеинов следовало ожидать на основе развития методов и лабораторной техники идентификации и количественного определения малых количеств сахаров и аминокислот, структурного анализа олиго- и полисахаридов, эффективного разделения и очистки белков, оценки гомогенности макромолекул и определения их молекулярных весов. С введением улучшенных методов исчерпывающего метилирования и периодатного окисления углеводов, реагентов (борогндридов щелочных металлов), избирательно восстанавливающих карбонильную группу, аналитической ультрацентрифуги Сведберга, аппарата Тизелиуса для электрофореза с подвижной границей, ультрафиолетовой и инфракрасной спектроскопии, метода меченых атомов, метода фракционирования белков плазмы крови холодным спиртом по Кону, хроматографии на бумаге и на колонках, хроматографии на ионообменниках, полученных из целлюлозы, упрощенных микрометодов электрофореза (электрофорез на бумаге, крахмальном или агаровом гелях), иммуноэлектрофореза и, наконец, последнего по времени, но важного в этой области открытия конститутивных и индуцируемых бактериальных ферментов, действующих избирательно на гетеросахариды, настало время для третьего и наиболее сложного и плодотворного периода исследования гликонротеинов. [c.18]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология