Сефароза

В обычной аффинной хроматографии для иммобилизации субстратов в качестве носителей используются агароза и сшитая сефароза. В качестве сшивающего агента обычно выступает ВгСМ, а мостик образован а,о)-диамином. Эти полисахаридные носители подвержены биодеградации, и, следовательно, органические полимерные гели более удобны в качестве матрицы и допускают более широкий набор химических модификаций. Именно эти причины побудили Уайт-сайдса и сотр. разработать новый метод иммобилизации ферментов в сшитых органических полимерных гелях [126]. По своей простоте и универсальности этот метод превосходит ранее предложенные. Особенно ценен он при иммобилизации относительно лабильных ферментов для использования в ферментерах большого размера при проведении реакций органического синтеза, катализируемых ферментами. [c.257]

Активация сефарозы бромцианом [c.347]

Марка сефарозы Концентрация агарозы, % Диаметр гранул, мкм Область фракционирования для глобулярных белков, тыс. Дальтон [c.119]

Рис. 74. Препаративная очистка полисом Е. oli на колонке сефарозы 4В (см. текст)

По-видимому, именно гидрофобности 28S РНК можно приписать и тот факт, что 60S субъединицы рибосом значительно легче связываются с сефарозой 4В, чем 40S субъединицы. При концентрации 0,3 М КС1 и температуре 4° 60S субъединицы задерживаются сефарозой на 90%, а связывание 40S субъединиц достигает 60% лишь в [c.179]

Биогели серии А. Американская фирма Bio-Rad выпускает агарозные матрицы для гель-фильтрации под торговым наименованием Bio-Gel А . Нет нужды останавливаться на свойствах этих матриц — они аналогичны тем, что были описаны для сефарозы. Ниже представлены параметры шести тппов этих матриц. [c.120]

Как видно из нриведеппых данных, процентное содержание агарозы в гелях отражено в маркировке этих матриц. Диаметры здесь даны для набухших гранул. На рис. 62 представлены графики селективности матриц сефарозы. [c.119]

В отличпе от сефадексов и обычной сефарозы, пористость сшитой сефарозы практически не лсеняется при переходе от водных растворителей к органическим. При этом она устойчива к пх воздействию, что облегчает проведение разнообразных химических реакций замещения с целью получения аффинных сорбентов. Вместе с тем отметим, что активация сефарозы L бромистым цианом (для присоединения аффинных лигандов) происходит с вдвое более низкой эффективностью, чем в случае обычной сефарозы. Это объясняется тем, что сшивка идет по тем же самым гидроксилам, что и активация с помощью Br N. [c.120]

Содержание остатков сульфокислоты в сшитой сефарозе гораздо ниже, а связанная с ними ионная сорбция — значительно слабее, чем у обычной сефарозы, поскольку в процессе ее изготовления осуществляется специальное десульфированпе путем щелочного гидролиза в восстанавливающей среде. Sepliarose L поставляется в виде густой водной суспензии с добавкой 0,02% азида натрия. Сама по себе сшитая сефароза очень устойчива к атаке микроорганизмов, но во избежание их роста в жидкой среде хранить эту сефарозу следует также в присутствии NaNg. [c.120]

Персон и соавторы отделяли гель-фильтрацией гибрид ДНК— РНК от не включившейся в него РНК. В качестве низкомолекулярного партнера фигурировала суммарная РНК из клеток HeLa, зараженных аденовирусом. Ее гибридизовали с высокомолекулярной ДНК аденовируса. Естественно, что в этом случае для отделения РНК пришлось использовать весьма крупнопористый гель — сефарозу 2В. Колонка размером 0,9 X 20 см была уравновешена и элюировалась 0,05 IVi Трис-НС1, pH 7,9, содержавшим 0,5 1VI Li l, 0,5% ДДС-Na и 1 мМ ЭДТА. Препараты вносили прямо в гибриди- [c.144]

Первые четыре типа производятся в виде сферических гранул трех дианазонов диаметров 150—300 мкм (50—100 МЕШ), 80— 150 мкм (100—200 МЕШ) и 40—80 мкм (200—400 МЕШ) два последних типа выпускаются в виде гранул только двух диапазонов 50 — 100 и 100—200 МЕШ. Отметим, что днаназон 200—400 МЕШ намного уже, чем диапазоны размеров гранул сефарозы, а это — немало- [c.120]

Уже упоминалось, что ввиду сжимаемости многих матриц для гель-фильтрацип перепад давлений, приходящийся на колонку, и максимальную скорость. элюцпи (эти величины взаимосвязаны) в ряде случаев следует ограничивать. Подчеркнем, что эти ограничения необходимы не только уже в ходе хроматографического процесса, но п во время заполнения колонки. Как будет показано ниже, наиболее мягкие матрицы не выдерживают даже гидравлического напора, обусловленного высотой самой колонкп. Разность уровней в этом случае надо уменьшать с помощью защитной петлп на ее выходе. Для сефадексов от 0-10 до 0-75, сефароз СЬ-6В и СЬ-4В, биогелей Р-2 — Р-10, А-0,5т и А-1,5т, а также всех сефакрилов эта проблема не возникает, поскольку они обладают достаточной [c.128]

Авторы дайной работы обратили внимание на то, что n продажной октилсефарозе L-4B фирмы Pharma ia имеются какие-то особо гидрофобные примеси. Часть исследуемого ими фермента сорбировалась на колонке так прочно, что ЭГ ее не снимал. Для элюции этой доли фермента нужно было использовать 1 %-ный раствор холата натрия. Столь прочное задержание части фермента было связано именно с особенностями матрицы, поскольку при внесении на новую порцию сефарозы препарата, ранее снятого с колонки эти-ленгликолем, часть его снова так же прочно сорбировалась на матрице. Можно предположить, что при модификации сефарозы в октиловом спирте присутствовали более высокомолекулярные примеси. [c.188]

Препаративную очистку полисом из 3—5 мл лизата Е. соИ, обработанного ДНКазой, проводили на колонке сефарозы 4В (2,5 X 33 см F = 165 мл). В элюенте присутствовало 10% глицерина, и скорость элюции была снижена до 4 — 5 мл/см -ч. Иа рис. 74 представлен профиль элюции. В заштрихованной области выходят очищенные полисомы, во фракции 63 — рибосомы, а в промежутке между ними обнаруживаются в различных пропорциях смеси чистых рибосом с комплексами, содержащими 2 — 3 рибосомы [Tai, Davis, 1979]. [c.142]

Никаких неприятностей не происходит, если воспользоваться сшитой агарозой. По данным Ансари и Мэйг, колонка с сефарозой L-6B выдерживала воздействие 6 М гуанидинхлорида без видимых изменений своих характеристик в течение 10 мес. Жесткость матрицы позволила им увеличить скорость элюции до 6,8 мл/см -ч. Авторы использовали колонку размером 1,5 х 90 см, а элюцию вели 6 М раствором гуанидинхлорида в 0,1 М Na-фосфатном буфере. pH 7. Для семи белков с молекулярными массами от 2900 до 69 ООО был получен совершенно линейный калибровочный график [Ansari, IVIage, 19771. [c.153]

Рассмотренный только что для обычной сефарозы, этот вариант элюции, естественно, находит применение и при использовании гидрофобизированной агарозы. В качестве примера процитируем недавно опубликованную работу по мягкой очистке HMG-белка из ядер печени на колонке со-аминобутилагарозы. Этот белок растворим в растворе сульфата аммония вплоть до концентрации, достигающей 70% от насыщения. Сначала такой концентрацией СА в нейтральном 0,01 М трис-буфере высаливали из экстракта ядер большое количество балластного белка. Затем надосадочную жидкость, содержащую около 40 мг белка, вносили на колонку размером 2 X X 30 см, уравновешенную тем же раствором СА. Элюцию вели снижающимся линейным градиентом концентрации СА в том же буфере (500 мл) со скоростью 20 мл/ч, т. е. примерно 7 мл/см -ч. Низкая скорость элюции характерна для всех опытов такого рода ввиду повышенной вязкости концентрированных солевых растворов и соответствующего снижения скорости диффузии макромолекул. Около 30% белка не садилось на колонку и удалялось при первоначальной промывке. В ходе элюции выходило четыре пика, в первом из которых методом электрофореза идентифицировали HMG-белок [ onner. omings, 1981]. [c.181]

В заключение упомянем, что довольно внушительный список калибровочных белков и пептидов со значениями молекулярных масс и Л ау ДЛЯ гель-фпльтрации на сефарозе 6В в 6 М растворе гуанидин-хлорида приведен в работе Брайса и Кричтона [Вгусе, ri hton, 1971], а также цитируется в уже упомянутой монографии [Mikes, 1979]. [c.154]

Еще в 1975 г. было обнаружено, что тонкое разделение [ H]Leu-тРНК на пять изоакцепторных фракций удается осуществить на колонке сефарозы 4В в обратном градиенте сульфата аммония (СА). Колонку размером 1,5 X 40 см уравновешивали 0,01 М Na-аце-татным буфером с pH 4,5, содержащим, кроме обычных добавок (Mg " и др.), еще и 1,3 М ((N 4)2804. На колонку вносили 100 мг суммарного препарата тРНК Е. соИ и вели элюцию 500 мл того же [c.176]

Метод 1 [Myers et al., 1980]. После предварительной очистки препарат вносили на короткую колонку (1x5 см) DEAE-целлюлозы элюцию вели 0,3 М К-фосфатным буфером (pH 7,2), содержавшим 2 мМ ДТТ, 10% глицерина и 0,2% NP-40 (вероятно, статический вариант хроматографии). На втором этапе очистку проводили в режиме динамической хроматографии с помощью точно такого же элюента, но на колонке СМ-сефарозы L-6B длиной 59 см. [c.308]

М КС1 (увеличивать концентрацию КС1 далее нельзя, так как начинается депротеинизация субъединиц). Полисомы в 0,3 М растворах KG1 нли Na l практически полностью задерживаются сефарозой. Таким образом, например, моя но выделить свободные полисомы из микросомальных фракций. При такой концентрации соли тРНК на сефарозе еще не задерживается [Petrovi et al., 1978]. [c.179]

Этот же принцип недавно был использован для разделения 40S и 60S субъединиц рибосом на колонках сефарозы 4В или биогеля А-15ш в солевом растворе неизменной концентрации (0,5 М KG1) с помощью изменения температуры. При 4° и указанной концентрации КС1 40S субъединицы очень слабо задерживаются агарозой и выходят четким пиком. Объем элюции лежит примерно посередине между свободным и полным объемами колонки. Затем при той же температуре вымывается пуромицин, использованный для диссоциации рибосом. Для снятия с колонки 60S субъединиц оказывается достаточным повысить температуру элюента до 35° — субъединицы выходят четким пиком [К. Man hester, J. Man hester, 1980]. [c.179]

Процедура активации состоит в следующем. 100 мл набухшей сефарозы промывают на бюхнеровской воронке 3—4 объемами деионизованной воды и суспендируют с медленным перемешиванием (как. в предыдущем методе) в 50—70 мл воды. Добавляют 10 мл бмс-окси-рана и 30 мл 2 М раствора NaOH, содержащего 0,2 г NaBH . Суспензию перемешивают в течение ночи при комнатной температуре под тягой, затем гель тщательно промывают деионизованной водой п переносят в колбу с буфером для посадки лиганда. Другие авторы рекомендуют несколько иное соотношение тех же реагентов [Uy, Wold, 1977]. [c.351]

В главе, посвященной распределительной хроматографпп, описано успешное фракционирование тРНК на колонках сефарозы в снижающемся градиенте концентрации сульфата аммоння. Метод весьма эффективен, но последующее обессоливанне связано с некоторыми трудностями. Осаждение этанолом непригодно, так как [c.324]

Полибуферы - ионообменники типов РВЕ 94 и РВЕ 118 устойчивы при pH 3—12, не боятся контакта с мочевиной их можно автоклавировать. Жесткость химически сшитой сефарозы допускает увеличение скорости течения элюента до 120мл/см -ч. Объемы обменников не изменяются при изменениях pH и ионной силы раствора (например, при промывке обменника 1 М Na l). [c.330]

Квадратиком отмечен уровень содержания Циановых групп в продажной сефарозе ЧВ, активированной Br N, фирмы .Pharma ia [c.350]

Общая органическая химия Т.11 (1986) -- [ c.275 ]

Жидкостная колоночная хроматография том 3 (1978) -- [ c.2 , c.256 , c.262 , c.294 ]

Аффинная хроматография (1980) -- [ c.0 , c.185 , c.225 , c.366 ]

Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков (1974) -- [ c.247 , c.250 , c.251 ]

Биологические мембраны Структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами (2000) -- [ c.4 , c.232 ]

Иммобилизованные ферменты (1987) -- [ c.14 , c.31 ]

Аффинная хроматография Методы (1988) -- [ c.16 , c.39 , c.90 ]

Методы исследований в иммунологии (1981) -- [ c.66 , c.68 , c.71 , c.160 , c.161 ]

Структура и функции мембран (1988) -- [ c.109 ]

Методы очистки белков (1995) -- [ c.0 , c.108 , c.111 , c.147 , c.188 , c.202 ]

Биосенсоры основы и приложения (1991) -- [ c.327 ]

Основы биохимии (1999) -- [ c.141 , c.190 , c.221 ]

Физическая Биохимия (1980) -- [ c.198 , c.199 , c.217 , c.218 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология