Хроматография аффинная сефарозе

Ситуация заметно ухудшается в том случае, когда связывание белкового лиганда с матрицей происходит не в одной, а в нескольких точках. Об этом уже упоминалось при анализе условий фиксации лигандов на Br N-активированной сефарозе довольно много было сказано и в предыдуп(ей главе. Тем не менее имеет смысл остановиться на этом вопросе еще раз — в аспекте аффинной хроматографии. Многоточечное связывание белка с матрицей может приводить как к недоступности активного участка белковой молекулы, так и к ее денатурации за счет растяжения, т. е. к потере биологической активности. [c.386]

Описано также фракционирование интерферона человека аффинной хроматографией на конканавалин А-сефарозе. При этом обна- [c.416]

Рис. 7.6. Хроматографическое выделение химотрипсина на незамещенной сефарозе (а) и выделение того же соединения методом аффинной хроматографии на сефарозе, с привитым метиловым эфиром е-аминокаприл-В-триптофана (б)

В обычной аффинной хроматографии для иммобилизации субстратов в качестве носителей используются агароза и сшитая сефароза. В качестве сшивающего агента обычно выступает ВгСМ, а мостик образован а,о)-диамином. Эти полисахаридные носители подвержены биодеградации, и, следовательно, органические полимерные гели более удобны в качестве матрицы и допускают более широкий набор химических модификаций. Именно эти причины побудили Уайт-сайдса и сотр. разработать новый метод иммобилизации ферментов в сшитых органических полимерных гелях [126]. По своей простоте и универсальности этот метод превосходит ранее предложенные. Особенно ценен он при иммобилизации относительно лабильных ферментов для использования в ферментерах большого размера при проведении реакций органического синтеза, катализируемых ферментами. [c.257]

Чаще всего в аффинной хроматографии используются сефарозы, к которым пришиваются реагенты, связывающие мембранные белки, в том числе транспортные (лиганд — транспортируемые вещества), белки-ферменты (лиганд — ингибитор или кофактор соответствующего фермента), гликопротеины (лиганд — конканавалин А), мембраны (лиганд — гормоны), антитела (лиганд — бромциан), целые клетки некоторых опухолей (лиганд — часто конканавалин А). [c.111]

Пептиды из нитрованного лизоцима, содержащие остатки нитротирозина, выделяли на сефарозе (Sepharose) с иммобилизованными антителами [45] (рис. 34.16). Антитела получали иммунизацией кроликов и коз комплексом нитротирозин—белок. Антитела выделяли из сыворотки методом аффинной хроматографии на сефарозе с фиксированным нитро-у-глобулином [46]. После десорбции 0,1 М уксусной кислотой антитела конденсировали с сефарозой, получая, таким образом, иммуносорбент. Последний использовали для выделения в одну стадию пептидов с остатком нитротирозина. [c.415]

Подобно аффинной хроматографии, аффинный электрофорез в геле можно применять для определения констант диссоциации комплексов белок — лиганд. Принцип метода заключается в изучении зависимости подвижности данного белка от концентрации связанного лиганда в геле. Этот лиганд может быть либо ковалентно связан с гелем, либо только включен в гель (последнее обусловлено высокомолекулярными свойствами лиганда). Впервые такое использование электрофореза описано Такео и Накамурой [50], (хотя в этой работе еще не введен термин аффинный электрофорез ) константы диссоциации комплексов фосфорилаза— полисахарид определены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем различные концентрации ковалентно связанного полисахарида. Бег-Хансен [9] применил электрофорез на сефарозе с ковалентно связанным конканавалином А для определения констант диссоциации комплексов конканавалина А с сывороточными гликоиротеинами. [c.168]

В настоящее время фирма Pharma ia выпускает новые носители для аффинной хроматографии — АН- сефарозу 4В, т. е. сефарозу с ковалентно связанным с помощью NBr 1,6-днаминогекса- [c.20]

Антитела к арс-гаптену выделяют с помощью аффинной хроматографии на сефарозе 4В, к которой присоединена арс-группа (Wofsy, Burr, 1969). [c.172]

Кроличьи антитела к идиотинам можно выделить из соответствующей антисыворотки (9 мл) аффинной хроматографией на сефарозе 4В (40 мл), к которой ковалентно привязаны антитела данного идиотипа (20 мг). Колонку промывают забуференный физиологическим раствором, адсорбированные антитела элюируют ЗМ NH4S N на том же растворе, а затем пропускают через вторую колонку с сефарозой, к которой ковалентно привязана смесь кроличьих IgG. На второй колонке из элюата удаляют связывающиеся неспецифически IgG. Элюат с колонки содержит 2,4 мг специфических антиидиотипических антител. (Sogn et al., 1976). [c.71]

Следует подчеркнуть, что большинство препаратов иммуноглобулина определенного класса обычно содержит примеси Ig других классов, за исключением IgG, выделенных хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, и IgM, выходящих в первом пике при хроматографии на сефадексе G-200. Поэтому рекомендуется проводить рехроматографию полученных препаратов на той же колонке и в тех же условиях, либо использовать какую-то иную процедуру, например электрофорез в агарозном блоке или гель-фильтрацию. Для той же цели можно применить и аффинную хроматографию на сефарозе с класс-специфической антисывороткой. Миеломные белки классов G, А и М и парапротеины при макроглобулинемии Вальденстрёма удается очистить одноэтапной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе или зональным электрофорезом, поскольку они являются основным компонентом сыворотки. Чистоту каждой фракции иммуноглобулинов исследуют с помощью иммуноэлектрофореза, двойной иммунодиффузии или радиоиммунным методом с класс- или подкласс-специфическими антисывороткамн. Чистые белки хранят при 4°С в присутствии 0,02% NaNs или замораживают растворы с концентрацией 10— 30 мг/мл. [c.72]

Рис. 137. Аффинная хроматография карбоксипептидазы А на связанной с сефарозой бензилянтарной кислоте с конкурентной элюцией различными концентрациями свободного лиганда [ ueni et al, 1980]

Случае была saMetHo прочнее, 4to позволило промывать колонку с сорбированным па пей препаратом 0,15 М раствором КСЛ в буфере, а элюцию вести линейным градиентом 0,15—0,9 М КС1. ДНК-по-лимеразная активность выходила широким пиком в ее последующей очистке использовалось еще три варианта аффинной хроматографии на генарин-сефарозе, ДНК-целлюлозе п олиго((1Т)-целлюлозе. [c.422]

Примеры И, 12. Очистка рецепторов гормонов. Рецепторы гормонов зачастую содержатся в тканях-мишенях в ничтожно малых концентрациях, но, как уже указывалось, обладают очень высоким сродством к гормонам, поэтому аффинная хроматография — единственный эффективный способ их очистки. Рецепторы тироид-ных гормонов экстрагируют из ядер концентрированными солевыми растворами. Очистку рецептора для 3,5,3 -трийодтиронина (Тз) из такого экстракта вели на колонке сефарозы с иммобилизованным [c.432]

Смит II соавторы с помощью аффинной хроматографии очищали рецептор прогестерона человека. Содержание рецептора в матке составляет лишь 0,002% суммарного белка, и оп весьма лабилен. В качестве лиганда использовали 11-дезоксикортикостерон. Гормон сажали на Br N-активнрованную сефарозу 41 в виде конъюгата с бычьим сывороточным альбумином. Полученный таким образом аффинный сорбент инкубировали 18 ч с частично очищенным цитозолем матки, промывали 0,4 М КС1 и элюировали мкМ раствором меченного тритием прогестерона. Рецептор выходил в комплексе с гормоном. Операция обеспечивала очистку в 10 ООО раз. Вместе с предварительной 6-кратной очисткой цитозоля осаждением сульфатом аммония это позволило авторам получить гомогенный препарат рецептора [Smith et al., 1981). [c.434]

Пример 14. Очистка полн(А)-РНК на олиго((1Т)-целлюлозе [Bantle et al., 1976]. Метод очпстки полп(А)-РНК из суммарной РНК полисом аффинной хроматографией на олиго(с1Т)-целлюлозе пользуется чрезвычайно широкой популярностью благодаря своей простоте и эффективности. Существенным преимуществом этого сорбента по сравнению с полп(и)-сефарозой является его неуязвимость для рибонуклеаз, присутствующих, как правило, в очищаемых препаратах РНК. [c.445]

Совершенствование аффинной хроматографии также позволило использовать очень специфическую технику очистки. Китаму-ра и др. [59] очищали И S-глобулин сои, пропуская экстракт через колонку сефароза — конканавалин А. Глобулин 7S, который представляет собой гликопротеин, удерживается в геле, тогда как И S-глобулин элюируется. Кэйзи [17] изолировал легумин гороха иммунной аффинной хроматографией на колонке сефарозы, в которую введен IgG-антилегумин. По свидетельству этого автора, данный метод можно применить ко всему набору сортов гороха, несмотря на некоторую генетическую изменчивость состава легумина. [c.155]

Агароза Сефароза СМ-сефароза Поперечно сшитый полиса-1 харид на основе нейтрального компонента агара Сшивка -СН2-СН(0Н)СН2-0-СН2- образуется в результате взаимодействия с 2,3-дибромпро-панолом Карбоксиметильная -О-СНг -СОО- Для фракционирования очень крупных молекул, высокополимерных ДНК вплоть до вирусов Носитель для аффинной хроматографии Катионообменная хроматография [c.239]

Методы разделения, основанные на использовании специфичного сродства биополимера к определенному партнеру, получили название аффинных методов разделения (от англ. affinity — сродство). Наиболее широко используемый вариант аффинных методов — это использование аффинных сорбентов. Специфические лиганды ковалентно присоединяются к соответствующему носителю, и выделяемое вещество либо адсорбируется таким сорбентом, либо отделяется от остальных компонентов с помощью аффинной хроматографии с использованием того же аффинного сорбента. Разнообразие мыслимых аффинных сорбентов неисчислимо, и практически невозможно приготовить все сорбенты в коммерчески доступном виде. Оптимальным для большинства задач является наличие носителя с реакционноспособными группами, который по усмотрению исследователя может быть использован для присоединения соответствующего лиганда, подходящего для решения поставленной задачи по разделению. Количество подобных реакционноспособных носителей весьма велико. Наиболее популярной является бромци-ансефароза, представляющая собой сефарозу, обработанную ВгС , который реагирует с гидроксигруппой сефарозы, превращая ее в остаток цианата [c.246]

Тирозин — аминотрансферазу выделяли методом аффинной хроматографии на пиридоксаминфосфатагарозе (сефарозе 4В) [61]. Фермент элюировали, изменяя состав буферного раствора. Препарат, прошедший на этой стадии 125-кратную очистку, подвергали далее гель-фильтрации на сефадексе G-200. ь-Тирозин-2-оксоглутарат—аминотрансфераза была выделена в виде смеси нескольких изоферментов. [c.19]

Рис. 5.4. Аффинная хроматография а-химотрипсина на колонках сефарозы с ингибитором [5]. Колонки (50X5 мм) предварительно уравновешивались 0,05 М трис-Н1 1-6у- ером (pH 8,0). Образец (2,5 мг) наносился в и,з мл того л с буферного рас твора. Колонки элюировались при комнатной температуре, скорость потока 40 мл/ч объем фракции 1 мл. Стрелки указывают замену элюента на 0,1 М уксусную кислоту (pH 3,0).

Емкость нерастворимых аффинантов, приготовленных путем присоединения 3 -(4-аминофенилфосфорил)дезокситимидин-5 -фосфата к производным сефарозы 4В и биогеля Р-300, в аффинной хроматографии стафилококковой нуклеазы [c.70]

Теоретически выведенная взаимосвязь между количеством сорбируемого фермента, концентрацией аффинного лиганда и константами равновесия лиганд — фермент рассмотрена в гл. 3. Из рис. 3.3 следует, что для систем с низким сродством Кь = = 10 2 моль/л) концентрация привязанного аффинного лиганда представляет собой критический параметр для получения эффективного сорбента. На рис. 5.6 показана аффинная хроматография глюкокиназы на 2-амино-2-дезокси-о-глюкопиранозо-N-(6-амино-гексаноил) —сефарозе при четырех концентрациях связанного аффинанта [15]. Видно, что оптимальная концентрация аффинного лиганда равна 3,75 мкмоль/г (рис. 5.6,6) при более низких концентрациях фермент не отделяется от неактивного материала, в то время как при более высоких концентрациях необходимо увеличить концентрацию глюкозы в элюате и при этом глюкокиназа выходит в большем объеме элюата. При концентрации 10 мкмоль/г глюкокиназа не может быть элюирована даже при высоких концентрациях глюкозы она может быть снята только пропусканием 0,5 М хлорида калия. [c.75]

Другим примером влияния концентрации аффинного лиганда является аффинная хроматография смеси лактатдегидрогеназы и сывороточного альбумина на N -(6-аминогексил)-5 -АМР — сефарозе [8]. При высоких концентрациях лиганда (1,5 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) для элюирования с )ермента необходимо введение NADH ( удар ). При низких концентрациях (0,125 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) десорбция фермента достигается просто градиентом концентрации (от О до 1 моль/л) хлорида калия. Дальнейшее уменьшение количества прикрепленного лиганда (0,025 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) приводит к прогрессивному увеличению доли лактатдегидрогеназы, элюируемой исходным уравновешивающим буфером даже перед наложением линейного градиента солей. В то же время [c.75]

В колоночной аффинной хроматографии достаточно сильное взаимодействие выделяемых веществ с иммобилизованным аффинным лигандом приводит к концентрированию вещества и его медленной миграции вниз по колонке. Этот процесс зависит от концентрации лиганда и почти не зависит от начальной концентрации свободных макромолекул. Например, в аффинной хроматографии глицерокиназы или лактатдегидрогеназы на К -(6-аминогексил)-5 -АМР— сефарозе не наблюдалось влияния концентрации фермента на емкость, если концентрации ферментов прямо пропорциональны концентрациям нуклеотида или зависимость между ними близка к таковой [21]. Необходимые при этом требования заключаются в том, что комплементарные макромолекулы следует наносить на колонку в ненасыщающих количествах, а также подбирать скорость потока раствора [19]. [c.82]

Ограниченная диффузия возникает, если молекулярная диффузия в порах матрицы затруднена из-за экранирования подхода макромолекул к прикрепленному аффинному лиганду. Экспериментально вклад этой диффузии можно определить с большим трудом, но для аффинной хроматографии на очень пористых носителях эти трудности становятся минимальными. На практике для достижения равновесных условий желательно, чтобы скорость потока была по возможности низкой. Например, при скорости потока 400 мл/ч для выделения стафилококковой нуклеазы на колонке объемом 20 мл небольшие количества нуклеазы появлялись в первом пике вместе с белковыми примесями, особенно если общая концентрация белков в образце была высока (20—30 мг/мл) [5]. Однако даже при такой высокой скорости потока нуклеаза полностью сорбировалась, если наносился менее концентрированный образец. Зависимость связывания лактатдегидрогеназы на №-(6-аминогексил)-5 -АМР — сефарозе от скорости потока пссле-дована Лоу и др. [21]. Было найдено, что увеличение скорости потока относительно мало влияет на сорбцию. При высоких скоростях потока эффективность колонки (ВЭТТ), а также связываемость р уменьшаются. Влияние скорости потока более заметно в небольших колонках, с которых часть белка с ферментативной активностью элюируется со свободным объемом. Влияния концентрации инертного белка (бычьего сывороточного альбумина) при высоких скоростях потока (67 мл/ч) также не обнаружено. [c.84]

Смотреть страницы где упоминается термин Хроматография аффинная сефарозе: [c.111] [c.265] [c.34] [c.119] [c.304] [c.343] [c.368] [c.418] [c.422] [c.423] [c.423] [c.432] [c.444] [c.444] [c.122] [c.123] [c.454] [c.16] [c.64] [c.68] [c.73] [c.80] [c.105] [c.108]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология