Сефароза, использование для хроматографии

Белки и пептиды, использованные как калибровочные соединения при определении молекулярных масс методом гель-хроматографии на сефарозе 6В при элюировании 6М раствором гуанидингидрохлорида [6] [c.389]

Использование гепарин-сефарозы в аффинной хроматографии описано далее в разд. 5. [c.151]

Иммобилизованные на Сефарозе катехоламины (например, адреналин) при наличии соответствующей вставки могут специфически взаимодействовать с солюбилизированным белком р-адренорецептора сердечной мышцы, что было показано методом афинной хроматографии. Следовательно, иммобилизованные катехоламины сохраняют возможность принять конфигурацию, необходимую для взаимодействия с рецептором. Реализация этой возможности зависит от типа функциональных групп катехоламинов, использованных для присоединения к полимеру, [c.80]

Многие интерфероны были в последнее время успешно очищены. Наиболее эффективные этапы очистки включают хроматографию на голубой сефарозе и веществах, хелатирующих Си и Zn [21, 127], адсорбционную хроматографию на пористом стекле [116, 267, 279] и иммуноаффинную хроматографию с использованием как поликлональных, так и моноклональных антител [30, 170]. Процедуры очистки с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН позволяют одновременно получать интерфероны разных классов [99]. [c.54]

В обычной аффинной хроматографии для иммобилизации субстратов в качестве носителей используются агароза и сшитая сефароза. В качестве сшивающего агента обычно выступает ВгСМ, а мостик образован а,о)-диамином. Эти полисахаридные носители подвержены биодеградации, и, следовательно, органические полимерные гели более удобны в качестве матрицы и допускают более широкий набор химических модификаций. Именно эти причины побудили Уайт-сайдса и сотр. разработать новый метод иммобилизации ферментов в сшитых органических полимерных гелях [126]. По своей простоте и универсальности этот метод превосходит ранее предложенные. Особенно ценен он при иммобилизации относительно лабильных ферментов для использования в ферментерах большого размера при проведении реакций органического синтеза, катализируемых ферментами. [c.257]

Методы разделения, основанные на использовании специфичного сродства биополимера к определенному партнеру, получили название аффинных методов разделения (от англ. affinity — сродство). Наиболее широко используемый вариант аффинных методов — это использование аффинных сорбентов. Специфические лиганды ковалентно присоединяются к соответствующему носителю, и выделяемое вещество либо адсорбируется таким сорбентом, либо отделяется от остальных компонентов с помощью аффинной хроматографии с использованием того же аффинного сорбента. Разнообразие мыслимых аффинных сорбентов неисчислимо, и практически невозможно приготовить все сорбенты в коммерчески доступном виде. Оптимальным для большинства задач является наличие носителя с реакционноспособными группами, который по усмотрению исследователя может быть использован для присоединения соответствующего лиганда, подходящего для решения поставленной задачи по разделению. Количество подобных реакционноспособных носителей весьма велико. Наиболее популярной является бромци-ансефароза, представляющая собой сефарозу, обработанную ВгС , который реагирует с гидроксигруппой сефарозы, превращая ее в остаток цианата [c.246]

Развитие аффинной хроматографии сопровождается увеличением количества продажных иммобилизованных аффинных лигандов. Для составления общей картины о применении некоторых веществ в практике аффинной хроматографии в табл. 11.1 перечислены промыптленные названия носителей и иммобилизованных аффинных лигандов. Из цитированной в таблице литературы очевидно, что в настоящее время очень возросло применение продажных п.ммобилизованных аффинных лигандов, например конканавалина А, связанного с сефарозой ( кон А — сефароза). Можно полагать, что то же ожидает и другие хроматографические материалы. Точно так же как сегодня в очень редких лабораториях готовят ДЭАЭ- и КМ-целлюлозу, совершенно закономерно, что будет постепенно увеличиваться использование продажных био-специфических сорбентов. Это справедливо прежде всего для сорбентов с групповой специфичностью или сорбентов специфических к веществам, постоянно получаемым в лабораториях, и обусловлено специфической природой аффинной хроматографии. Из разнообразия биологически активных веществ следует, что необходим очень широкий ассортимент специфических сорбентов поэтому много научных работников, по-видимому, будут вынуждены сами готовить специальные высокоэффективные сорбенты. [c.137]

Подобно аффинной хроматографии, аффинный электрофорез в геле можно применять для определения констант диссоциации комплексов белок — лиганд. Принцип метода заключается в изучении зависимости подвижности данного белка от концентрации связанного лиганда в геле. Этот лиганд может быть либо ковалентно связан с гелем, либо только включен в гель (последнее обусловлено высокомолекулярными свойствами лиганда). Впервые такое использование электрофореза описано Такео и Накамурой [50], (хотя в этой работе еще не введен термин аффинный электрофорез ) константы диссоциации комплексов фосфорилаза— полисахарид определены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем различные концентрации ковалентно связанного полисахарида. Бег-Хансен [9] применил электрофорез на сефарозе с ковалентно связанным конканавалином А для определения констант диссоциации комплексов конканавалина А с сывороточными гликоиротеинами. [c.168]

Колоночная хроматография с использованием иммобилизованного бычьего сывороточного альбумина, присоединенного непосредственно к сефарозе 4В, сывороточного альбухмина, присоединенного к сукциниламиноэтилагарозе, или обезжиренного сывороточного альбумина (по методу Чена [195]), присоединенного также к [c.368]

Большой интерес. представляет применение магнитных полимеров в качестве носителей для биологических молекул. Преимущество таких препаратов состоит в легкости их выделения при наложении магнитных полей. Мосбах и Андерсон [1] разработали общий метод применения магнитных жидкостей, позволяющий намагничивать полимеры после их модифицирования биологическими молекулами. Магнитные жидкости —это жидкости, состоящие из взвешенных ультрамикроскопических частиц ( 100 А) магнитной окиси железа. Частицы магнитной жидкости стабилизованы покрытием толщиной 25 А, предотвращающем их слипание в магнитном поле. Эти частицы удерживаются в виде коллоидной суспензии за счет броуновского двилсеиия. Магнитные жидкости (феррофлюиды), содержащие частицы феррита, были использованы в виде коллоидов в воде или углеводородах. Они ведут себя как истинно гомогенные жидкости, однако весьма чувствительны к воздействию магнитного поля. Для получения магнитного аффинного сорбента сорбент на основе сефарозы обрабатывают феррофлюидом с последующим намагничиванием в магнитном лоле. Использование магнитных полимеров в аффинной хроматографии позволяет быстро вытаскивать молекулы из коллоидных растворов или растворов с культурами клеток и мицелием. Такое быстрое вытаскивание молекул очень трудно достижимо или совершенно невозможно лри обычных методах выделения. [c.450]

В табл. 6.14 дан список белков, использованных Брайсом и Кричтоном [6] для калибровки заполненной сефарозой 6В колонки при элюировании 6М раствором гуанидингидрохлорида, а на рис. 6.18 показана кривая зависимости gM от Kav При определении с применением гель-хроматографии ранее неизвестных молекулярных масс следует помнить, что полученные значения молекулярных масс являются лишь приближенными и их необходимо подтвердить с помощью другого независимого метода, например ультрацентрифугирования. Определяя молекулярные массы методом гель-хроматографии, всегда следует проводить калибровку при данных экспериментальных условиях на нескольких соединениях подобного же типа с различными, но заранее известными молекулярными массами. [c.390]

Аминогексил- или 6-аминогексаноатсефарозу связывают с лигандом карбодиимидным методом. Высущенный материал взвешивают и погружают для набухания в раствор 0,5 М Na l (1 г = 4 мл геля). Предназначенный для связывания лиганд (белок или низкомолекулярное вещество) растворяют в воде или водном растворителе и доводят pH до 4,5. К сефарозе добавляют такой объем водного раствора гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида, чтобы получилось 10 мг набухшего геля на 1 мл. Гель и карбодиимид перемешивают в течение ночи при комнатной температуре (нельзя использовать магнитную мешалку). Избыток реактивов удаляют промыванием той же смесью воды и растворителя, которая будет использована на последующем этапе связывания лиганда. Полученный конъюгат можно хранить при 4—8°С. Предназначенный для связывания лиганд растворяют в воде или смеси воды и растворителя, доводя pH водной фазы до 4,5, при этом никакого буфера не используют. Величину pH, которая снижается, главным образом в начале реакции, поддерживают на уровне 4,5, добавляя NaOH. Связанный с лигандом гель тщательно промывают связывающим раствором нет необходимости блокировать избыточные группы. После промывки в дистиллированной воде, а затем в буфере гель готов для использования в аффинной хроматографии. Материал можно хранить при pH 7,0 и температуре ниже 8°С без замораживания. [c.219]

При использовании мягких гелей (сефадекс, биогели) разделение по размерам молекул занимает много времени. Появление жестких носителей для гель-хроматографии дало возможность сократить время, необходимое для разделения белков и пептидов этим методом. Применение сорбентов, устойчивых к сжатию (ультрагель, сефароза), помогло добиться большей эффективности разделения, проводимого в обычных (насыпных) колонках. [c.198]

В работе [73, 74] выделены витамин В12-связывающие белки с использованием аффинной хроматографии на витамин В12-сефарозе, Производные витамина В12 можно получить частичным кислотным гидролизом (в 0,4 М H I в течение 64 ч при комнатной температуре) амидных групп незамещенных пропион-амидных боковых цепей корринового кольца витамина Bt2- Полученная смесь MOHO-, ди- и трикарбоксипроизводных витамина Bi2 может быть разделена хроматографией на QAE-сефадексе. [c.189]

Применение аффинной хроматографии в качестве метода изучения взаимодействий находится еще на ранней стадии развития, несмотря на то что количественная аффинная хроматография была введена уже десять лет назад [1—3]. Действительно, количество исследований, касающихся методологических аспектов аффинной хроматографии, примерно равно количеству сообщений по применению этого метода в конкретных экспериментальных системах. Большинство этих исследований способствовало применению аффинной хроматографии для оценки равновесия с участием ферментов и модификаторов, ингибиторов или субстратов [1—12], но метод был также использован и для характеристики взаимодействий белок — лекарственный препарат [13], система антиген — антитело [14] и, в меньшей степени, белок-белковых взаимодействий [15, 16]. По существу метод заключается в иммобилизации биоспецифической реагирующей группы X на инертной хроматографической матрице (например, часто на сефарозе) и определении средневзвешенных величин объема элюирования Уа распределяющегося растворенного вещества А в ряде хроматографических экспериментов, в которых растворенное вещество мигрирует в присутствии различных концентраций лиганда 5, также специфически взаимодействующего с А и/или X, В некоторых примерах различные изменения значения Уа отражали конкуренцию между растворенными и иммобилизованными реагентами за одно и то же положение в А [2—5, 7—14] в других изменения в величинахГд были обусловлены наличием взаимодействия иммобилизованного реагента X с бинарным А5-комплексом, образованным растворенным веществом и растворимым лигандом [1, 6]. Цель количественной аффинной хром ографии — объяснить возникновение изменений в величинах Га в предложении существования тех или иных равновесий. Поскольку положение равновесия зависит от концентрации (в соответствии с законом действия масс), точное определение состава смеси реагентов, к которой относится Га, обеспечивает применение фронтальной хроматографии [3, 4]. [c.192]

В одном из них [14] для интерпретации фосфорилхолинзависи-мого элюирования иммуноглобулина А с сефарозы, содержащей ковалентно связанный фосфорилхолин (иммобилизованный реагент X), был использован приближенный анализ [17] результатов зональной хроматографии. Другие исследования были посвящены фосфатзависимому элюированию альдолазы с фосфо-целлюлозы [18] и с миофибрилл мышц кролика [28] и ЫАОН-зависимому элюированию лактатдегидрогеназы с 10-карбокси-дециламино-сефарозы [32]. Все четыре системы относятся к примеру 3, включающему конкуренцию между 5 и X за положения связывания растворенного вещества. [c.207]

На протяжении последнего десятилетия мы стали свидетелями появления количественной аффинной хроматографии как метода изучения взаимодействий между различными реагирующими веществами. Этот еще относительно молодой метод вызывает несомненный интерес, поскольку в некоторых случаях дает возможность на основе специфического взаимодействия с иммобилизованным реагентом количественно оценивать обратимую реакцию, протекающую в биологических условиях, что продемонстрировано на примере использования оксамат-сефарозы для изучения взаимодействия NADH с различными изоферментными формами лактатдегидрогеназы в неочищенном тканевом экстракте [6]. Другим преимуществом аффинной хроматографии, вероятно, является отсутствие каких-либо ограничений для значений констант равновесия, которые могут быть измерены этим методом. Из двух рассмотренных здесь подробно примеров очевидно, что количественная аффинная хроматография весьма удобна для характеристики относительно слабых взаимодействий ( As<1000 М ), оценка которых вызывает затруднения при использовании других методов, таких, как равновесный диализ , из-за сложности измерения различий между полной и свободной [c.214]

БНФ-П<ефароза. В дополнение к лиганд-связывающей активности нейрофизинов (как описано выше), это семейство белков обладает также свойством самоассоциировать с образованием димеров из мономерных субъединиц. Это взаимодействие было изучено количественно методом аффинной хроматографии с использованием матрицы, представляющей собой бычий нейрофизин II (БНФ-П), присоединенный к сефарозе [4, 21, 22]. Сорбент БНФ-П-сефароза может быть получен в результате одностадийной реакции между NBr-активированной сефарозой и БНФ-П в 0,1 М бикарбонате натрия (pH 8,5), содержащем 0,5 моль/л хлорида натрия, при осторожном перемешивании в течение ночи при 4°С. Полученный гель промывают буфером для присоединения и перемешивают с 1,0 М этаноламином в том же буфере в течение 3 ч при комнатной температуре, затем промывают буфером для присоединения и 0,1 М ацетатом, содержащим 1 моль/л хлорида натрия (pH 3,5). Замещенная матрица для аналитического эксперимента, описанного в разд. 6.4, была получена взаимодействием 1 г активированной сефарозы с 5 мг БНФ-П и содержала по данным аминокислотного анализа 1,4 мг БНФ-П/мл упакованного геля. [c.229]

Рис. 5. Аффинная хроматография с конкурентным зональным элюированием для системы с бивалентным связыванием. Зоны (100 мкл) мономера [ ]IgA (бивалентное связывание) наносми на фосфорилхолин-сефарозу с высокой плотностью лиганда (7X25 мм, [Ь]=5-10-5 моль/л), уравновешенную МаСЬ натрийфосфатным буфером (содержащим 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина) фосфорилхолин имел следующие концентрации (моль/л) 7 — 0 2—1 10- 5 —2,5-10-6 4 — 5,010- 5 — 7,5-10- 5—1,0-10-5. Элюирование осуществляли при комнатной температуре буфером, содержащим указанное количество растворенного конкурентного фосфорилхолина. В правом верхнем углу по данным элюирования построена зависимость 1/(К—Уо) от концентрации фосфорилхолина. Константы диссоциации /Сь и /Сп рассчитаны с помощью этого графика с использованием уравнения (5) и приведены в табл. I [9].

В. Специфичность связывания малых пептидов открывает возможность использования аффинной хроматографии для выделения рецептора фибронектина, и эта стратегия была успешно применена. Сначала пептид, содержащий связывающую рецептор последовательность RGD, сорбировали на матриксе колонки, в данном случае на сефарозе. Затем через колонки пропускали растворенные детергентами белки плазматической мембраны, соблюдая условия, способствующие взаимодействию между рецептором и фибронектином. Далее колонку тщательно промывали для удаления несвязанных белков. Наконец, рецептор снимали с колонки, добавляя к отмывающему буферу пептид GRGDSP. При этом элюировался единственный белок с мол. массой 140 кДа. (Если использовали GRGESP, этого не происходило.) [c.496]

В большинстве случаев для получения функционально очищенных препаратов рестриктаз необходимо проведение 2— 4 стадий очистки, в том числе 1—-3 хроматографических. Некоторые схемы выделения оказались приемлемыми для выделения многих рестриктаз. Среди таких можно отметить схемы, включающие стадию удаления нуклеиновых кислот гельфильтрацией или путем их высаждения при помощи СС или ПЭИ, высаливание сернокислым аммонием (не во всех случаях) и последовательную хроматографию на ФРП и ДЭАЭц в указанном или обратном порядке [28, 62, 89, 90, 92, 98, 104, 122, 156, 164, 166, 167, 180, 186, 218, 219, 220, 224, 225, 247, 262, 265, 271, 294, 296, 297 и др.]. Включение в схемы выделения наряду с указанными ионитами или вместо одного из них ГС [43, 44, 68, 85, 91, 130, 145, 173, 249, 262, 282, 293 и др.,] или ГАП [17, 23, 38, 88, 105, 202, 203, 209, 288 и др.] еще более расширяет список рестриктаз, очищенных с использованием ограниченного набора сорбентов. Реже в схемы очистки включается карбоксиметилцеллюлоза [106], ДНК-агароза/целлюлоза [58, 146, 174], w-аминопентилсефароза [31, 100, 303], фенилсефароза [18, 27], голубая сефароза [18, 32, 102, 211, 289], гельфильтрация с использованием се- [c.158]

Смотреть страницы где упоминается термин Сефароза, использование для хроматографии: [c.180] [c.180] [c.368] [c.418] [c.422] [c.643] [c.68] [c.108] [c.111] [c.112] [c.156] [c.186] [c.218] [c.219] [c.276] [c.279] [c.380] [c.8] [c.175] [c.217] [c.196] [c.119] [c.162] [c.228] [c.231] [c.149] [c.167]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология