Депротеинизация

Тотальное выделение НК можно подразделить на следующие этапы 1) разрушение растительной ткани 2) растворение ДНП и РНП в экстрагенте 3) депротеинизацию 4) очистку. [c.54]

ДЕПРОТЕИНИЗАцИЯ ж. Удаление белка или очистка от белка. [c.122]

Рис. 4.13. Скрининг библиотеки геномной ДНК с применением меченого зонда. Клетки после трансформации высевают на твердую питательную среду, обеспечивающую рост только трансформированных клеток. 1. Переносят клетки из каждой выросшей колонии на твердую подложку (например, нитроцеллюлозный или найлоновый фильр) так, чтобы их расположение соответствовало таковому на чащке. 2. Клетки лизируют, высвободившуюся ДНК подвергают денатурации и депротеинизации и фиксируют на фильтре. 3. На фильтр наносят меченый ДНК-зонд и проводят гибридизацию. Смывают с фильтра негибридизовавшийся зонд и проводят радиоавтографию с тем чтобы определить, какие клетки содержат меченый ДНК-зонд. 4. Идентифицируют на чашке колонии, содержащие искомую ДНК (положительный гибридизационный сигнал), отбирают из них материал и культивируют.

Депротеинизация Фенол, органические растворители (хлороформ), додецилсульфат натрия 5, 7, 16 [c.66]

Экстракцию РНК из рибосом проводят методом фенольной депротеинизации. Процедуру выделения рекомендуется проводить в присутствии ингибиторов РНКаз, поскольку высокополимерные рибосомные РНК могут подвергаться расщеплению нуклеазами. [c.170]

Обычно хитин представлен в природе в смеси с белками, минеральными солями (в основном карбонатом кальция). В панцирях он связан с белками в единый хитин-белковый комплекс ацетальными, амидными, сложноэфирными связями. Выделение хитина обязательно включает деминерализацию (обработку минеральными кислотами, растворяющими соли) и депротеинизацию (экстракцию белков слабощелочным раствором или обработку ферментами). Его выделение из сырья, содержащего большое количество жиров, проводится после предварительного обезжиривания, например обработкой четыреххлористым углеродом с последующим гидролизом [96]. При выделении хитина из грибов используют менее концентрированные растворы кислот и щелочей, так как грибы содержат значительно меньше белков и минеральных солей, чем ракообразные. [c.386]

После всех депротеинизаций ДНК осаждают 2—2,5 объемами этанола и осадок растворяют. [c.59]

При депротеинизации вместо ДДС можно применять смеси хлороформа с изоамиловым спиртом (24 1), хлороформа с амиловым спиртом (3 1) или щелочной фенол. [c.60]

Нами замечено, что дополнительные депротеинизации лучше проводить с использованием фенола pH 7,8. При этом для пол- [c.64]

При выделении НК необходимо тщательно следить за pH фенола и его насыщенностью водой. При депротеинизации любого экстракта (если раствор фенола имеет pH 7,4—8,0) в водной фазе обнаруживают ДНК и РНК. [c.70]

Депротеинизация гомогенатов фенолом на холоду идет хуже, чем при комнатной температуре. В первом случае для депротеинизации лучше использовать смесь фенола с м-крезолом (500 г чистого фенола, 70 мл м-крезола, 55 мл воды и 0,5 г 8-оксихинолина). [c.70]

Выделение РНК. К водному раствору, содержащему РНК, добавляют для дополнительной депротеинизации фенол pH 6,0 (1/2 объема), интенсивно встряхивают 20 мин и центрифугируют на холоде (600 g, 30 мин). Верхний слой отсасывают и для осаждения РНК приливают в стакан с тройным объемом хорошо охлажденного этанола п оставляют в холодильнике на 1 ч (не рекомендуется в этой стадии оставлять на более длительное время, так как возможна денатурация РНК). Выпавший осадок РНК собирают центрифугированием на холоде (3000 g, 10 мин) и затем растворяют в небольшом количестве воды. Нерастворившийся осадок удаляют центрифугированием и отбрасывают. Препарат разливают на порции и хранят в замороженном состоянии или в холодильнике с добавлением нескольких капель толуола. Полученный препарат РНК содержит высоко- и низкополимерную фракции. [c.168]

Авторы этой главы определили содержание свободных аминокислот в сыворотке после депротеинизации и очистки на смоле дауэкс-50 — эта процедура, вероятно, необходима в случае всех образцов биологического происхождения, для которых существует вероятность загрязнения большим избытком белка. Элюированные с бумаги пептиды можно сконцентрировать перед гидролизом адсорбцией на маленьких колонках с дауэксом-50 (в Н+-форме) с последующим количественным вымыванием смесью триэтиламина, воды и ацетона (24 24 7). В опытах с добавлением аминокислот к исчерпывающе диализован- [c.130]

ДНК вирусов и фагов (обзоры — см. ). Выделение ДНК из вирусов является относительно простой задачей, поскольку вирусные частицы могут быть получены в высокоочищенном состоянии и во многих случаях для получения ДНК необходимо лишь отделить белок. В этом случае можно применять максимально мягкие методы выделения з , например депротеинизацию концентрированным раствором перхлората натрия Операции, вызывающие гидродинамический сдвиг, можно свести к минимуму, и ДНК вирусов удается получать в высокополимерном состоянии. Процесс выделения вирусных ДНК и их нативность легко контролировать, так как эти соединения имеют легко измеряемую количественно биологическую активность (инфекционность). [c.31]

Всякому структурному исследованию ДНК или РНК предшествуют выделение их из клеток, очистка и фракционирование. Поскольку в клетке нуклеиновые кислоты практически всегда находятся в комплексес белками (т. е. в вил, нуклеопротеидов), их выделение сводится в основном к очистке от белков (депротеинизации). Чаще всего нуклеиновые кислоты экстрагируют из гомогенатов клеток или очищенных клеточных органелл смесью фенол — вода В присутствии ионных детергентов (например, додецилсульфата натрия). При этом белки (и ряд других клеточных компонентов) переходят в органическую фазу, а нуклеиновая кислота остается в водной фазе. Из водного раствора ДНК или РНК осаждают спиртом. [c.10]

При гидролизе РНК вируса табачной мозаики действием гуанил-РНК-азы удалось выделить три длинных олигонуклеотида уникальной последовательности для локализации их положения в молекуле РНК использован прием частичной депротеинизации РНК фага. Известно, что депротеинизация фаговой РНК под действием додецилсульфата происходит последовательно, начиная с 5 -конца цепи PHK s. Прерывая процесс депротеинизации в разные моменты времени и расщепляя освободившуюся РНК, можно определить относительное расположение различных фрагментов. [c.81]

Осаждение белков фенолом с целью их удаления (депротеинизация) получило широкое распространение при выделении и очистке нуклеиновых кислот и специфических полисахаридов. К числу последних относятся вещества, от которых зависит принадлежность крови человека к той или иной группе (изоантигены системы ABO). [c.67]

Рибосомную РНК можно получить путем депротеинизации очищенных рибосом [39]. Эта РНК состоит из двух главных и одного минорного компонентов обнаружить их можно путем [c.23]

Депротеинизация достигается также добавлением сульфата аммония и некоторых органических растворителей [23]. Основная опасность здесь заключается в возможности адсорбции или окклюзии следовых компонентов осадком. Эффективность операции нужно конфолировать в отношении биоматериала и определяемых веществ. Обычно влияние окклюзии сводят к минимуму не добавлением осаждающих агентов к пробе, а наоборот [24]. В последнее время для осаждения белков все чаще применяют ацетонитрил, особенно удобный в тех случаях, когда раствор далее анализируют методом ВЭЖХ Для предотвращения разложения белков следует избегать нафевания, либо использовать мягкие условия их разрушения с помощью ферментов [25]. С этой целью используют трипсин, папаини другие протеиназы. Ткани печени гидролизуют алкалазой, а [c.204]

М КС1 (увеличивать концентрацию КС1 далее нельзя, так как начинается депротеинизация субъединиц). Полисомы в 0,3 М растворах KG1 нли Na l практически полностью задерживаются сефарозой. Таким образом, например, моя но выделить свободные полисомы из микросомальных фракций. При такой концентрации соли тРНК на сефарозе еще не задерживается [Petrovi et al., 1978]. [c.179]

Метод предполагает получение высокополимерных ДНК и РНК, свободных от белков. Под действием водонасыщенного фенола на ну-клеопротеиды осуществляется их депротеинизация, причем при различных значениях pH для дезокси- и рибонуклеопротеидов. Обработка фенолом инактивирует нуклеазы, что позволяет получать нуклеиновые кислоты в нативном состоянии. [c.167]

В работе [73] описан автоматический метод анализов органических кислот, предусматривающий использование колонок с силикагелем элюентом служили смеси хлороформа и грег-амило-вого спирта. Концентрация грег-амилового спирта в элюенте непрерывно увеличивалась в градиентном устройстве Уаг1 га(1, и смесь насосом подавалась в колонку. Индивидуальные разделенные кислоты, присутствующие в элюате, реагировали с индикатором (о-нитрофенол в абсолютном метаноле), который непрерывно подавался в поток элюата появляющееся при этом окрашивание регистрировалось проточным фотометрическим детектором при 350 нм. Этот метод был успешно применен для разделения ряда физиологически активных кислот, таких, как промежуточные соединения цикла Кребса. Чувствительность пр проведении серийных разделений этим методом примерно в 40 раз выше, чем при стандартном ручном методе, точность метода выше 3%. Кроме того, до введения образца не требуется предварительная депротеинизация и экстракция (с возможной потерей летучих веществ и получением случайных ошибочных результатов). [c.181]

Источником получения ДНК обычно является ви-лочковая железа (тимус) телят, т. к. в ее клетках ядра составляют больше половины объема. Для получения РНК удобнее всего использовать дрожжи. Н. к. всегда тесно связаны с белками в нуклеопротеидных структурах. Для их освобождения проводят денатурацию белков добавлением к взвеси клеток (предварительно вскрытых путем разрушения их оболочки ) р-ра фенола высокой концентрации, а также нек-рых детергентов (напр., додецилсульфата) или хлороформа. Обычно фенольная депротеинизация ведется так, что фенола дается большой избыток и после отстаивания или центрифугирования образуются два слоя внизу — фенол, насыщенный водой, сверху — вода, насыщенная фенолом. Денатурированные белки сосредоточиваются в нижнем слое и у границы раздела, Н. к.— в верхнем водном слое, откуда их осаждают спиртом. При фенольной экстракции возможно частичное фракционирование Н. к. на ДНК (растворяется преимущественно при pH9) и РНК (растворима и при рН5). Однако полностью отделить ДНК и РНК друг от друга удается только дополнительным воздействием специфическими гидролитич. ферментами ДНК-азой и РНК-азой. Эти ферменты добьхваются из поджелудочной железы рогатого скота, подвергаются тщательной очистке и кристаллизации. Действуя ДНК-азой, разрушают ДНК и получают чистую РНК. С помощью РНК-азы очищают ДНК от РНК. После ферментативной обработки полученные продукты снова подвергают фенольной депротеинизации с последующим осаждением Н. к. спиртом. [c.189]

Дальнейшая работа по изучению механизма генного контроля синтеза глобулинов семян гороха была направлена на ноиски способа дерепрессии гепа, ответственного за синтез глобулина семян, в хроматине из почек гороха. Результаты одного из экспериментов но дерепрессии приведены в табл. 66. В этой серии экспериментов из хроматина удаляли весь белок, связанный ионными связями. Как уже было сказано в гл. 4, такой белок нредставляет собой главным образом или исключительно гистон. После депротеинизации хроматина остается ДНК. При использовании такой освобожденной от гистона ДНК из хроматина почек гороха в качестве матрицы д.тя синтеза информационной РНК, а затем для синтеза белка рибосомной системой наблюдается синтез значительных количеств глобулина семян (табл. 66). [c.524]

Нити ДНК растворяют в небольшом количестве 0,1XSS . К полученному раствору ДНК прибавляют Vio часть (по отношению к раствору ДНК) 10XSS . Когда раствор ДНК станет однородным, к нему приливают равный объем смеси из хлороформа с изоамиловым спиртом. Полученную эмульсию смешивают 15 минут, центрифугируют и отделяют водносолевой слой. Повторные депротеинизации проводят до исчезновения второго (белкового) слоя. [c.59]

При повторных депротеинизациях растворимость ДНК снижается, поэтому вторые слои промывают небольшими объемами 0,1 XSS и проверяют н-а присутствие ДНК (по цветным реакциям на дезоксирибозу). [c.59]

В водном растворе соли высокой концентрации ДНП диссоциируют на ДНК R белок. Это свойство попользуют при депротеинизации ДНК анионным детергентом (ДДС), применяя в качестве водной фазы 1 М раствор Na l. Метод применим для выделения ДНК в больших количествах [21], [35]. [c.60]

Как уже отмечалось, НК содержатся в объединенном водносолевом слое, который после заключительной депротеинизации тщательно отсасывают и сохраняют на холоду, а вторые и четвертые слои после всех депротеинизаций объединяют и для полноты извлечения НК обрабатывают следующим образом. К о бъединенным вторым и четвертым слоям добавляют 1,5 объема (по отношению к навеске) экстрагирующей смеси 0,14 М Na l — 0,01 М Mg U — 5% ПАСК и равный объем фенола, pH 7,8 с хлороформом.. [c.65]

Депротеинизацию проводят так же, как и с экстрактом 1 (проводят 2—3-кратную фенольную обработку с применением 5%-ного раствора ПАСК и фенола, pH 8,0). Осаждение НК проводят как из экстракта 1. Промытый осадок НК, выделенный из 1,5 М Na l-экстракта растворяют в 0,1 М Na l, диализуют и осветляют (см. стр. 65). [c.66]

Извлечение холодной фенольной обработкой (экстракт 3). Остаток после обработки 1,5 М Na l суспензируют в течение 3 минут в 3,5 объемах (по отношению к взятой навеске) 1 М Na l. К суспензии добавляют равный объем водонасыщенного охлажденного фенола pH 8,0. После 30-минутного смешивания суспензию расслаивают центрифугированием при 2500 g в течение 40 минут и температуре 1°. Верхний слой повторно депротеинизируют смесью фенола с ПАСК- Депротеинизацию НК проводят так же, как в экстрактах 1 и 2. [c.66]

Для более глубокого исследования характера воздействия ионола на биосинтез РНК нами было проведено хроматографическое разделение препаратов тотальной РНК, выделенных из асцитных клеток животных, на колонках с метилированным альбуМином, адсорбированным на кизельгуре (МАК) в градиенте Na l [14], Выделение РНК из асцитных клеток проводили по методике Шеррера и Дарнеллга с пятикратной депротеинизацией без поли- [c.345]

Ядро характеризуется высоким содержанием нуклеиновых кислот. В связи с этим, а также вследствие важной функциональной роли ДНК и РНК в клетке выделение и определение этих нуклеиновых кислот относится к числу наиболее важных методов биохимии ядер. Для выделения и определения нуклеиновых кислот разработано много методов. Ниже приведены те из них, которые используются при работе с высшими растениями. ДНК можно выделить в чистом виде из хроматина путем депротеинизации по методу Мармура [36] согласно этому [c.31]

Для выделения транспортных РНК из тканевого гомогената применяют депротеинизацию фенолом с последующим удалением других примесей, например путем адсорбции РНК на ДЭАЭ-целлюлозе и элюции. Затем транспортные РНК осаждают спиртом. Из дрожжей или Es heri hia oli можно выделять транспортные РНК в больших количествах прямой обработкой клеток фенолом [26,34]. Описан также способ получения больших количеств транспортных РНК из зародышей пшеницы [20]. [c.197]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология