Сефароза температуры

По-видимому, именно гидрофобности 28S РНК можно приписать и тот факт, что 60S субъединицы рибосом значительно легче связываются с сефарозой 4В, чем 40S субъединицы. При концентрации 0,3 М КС1 и температуре 4° 60S субъединицы задерживаются сефарозой на 90%, а связывание 40S субъединиц достигает 60% лишь в [c.179]

После того как растворение лиганда закончено, тем же буфером быстро промывают расчетное количество активированной сефарозы, вносят ее в стакан с раствором лиганда и осторожно перемешивают механической мешалкой в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи на холоду. К этой простой операции нам придется сделать довольно подробный комментарий. [c.376]

Для получения растворимых денатурированных субъединиц апо-фермент глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы из дрожжей в концентрации 2,5—3,5 мг/мл инкубируют в течение 1 ч в 8 М растворе мочевины (за полнотой денатурации следят по изменению активности фермента). Полностью денатурированные субъединицы добавляют к суспензии иммобилизованных мономеров в 8-кратном избытке по отношению к связанному с сефарозой белку. Эту процедуру проводят трижды с 30-минутными интервалами между добавками при постоянном перемешивании и температуре 25° С. Несвязавшийся белок отмывают 0,1 М Ма-фосфатом. Определяют содержание белка и активность в препарате после реассоциации. [c.303]

Рис. 5.11. Влияние температуры на емкость №-(6-аминогексил)-5 -АМР—сефарозы [91.

Тиолы, связанные с сефарозой, можно определять, исходя из их способности включать [ С]иодацетамид для этого модифицированная сефароза обрабатывается 0,01 М иодацетамидом в 0,1 М бикарбонате натрия (pH 8,0) при комнатной температуре в течение 15 мин [14]. [c.243]

Этот же принцип недавно был использован для разделения 40S и 60S субъединиц рибосом на колонках сефарозы 4В или биогеля А-15ш в солевом растворе неизменной концентрации (0,5 М KG1) с помощью изменения температуры. При 4° и указанной концентрации КС1 40S субъединицы очень слабо задерживаются агарозой и выходят четким пиком. Объем элюции лежит примерно посередине между свободным и полным объемами колонки. Затем при той же температуре вымывается пуромицин, использованный для диссоциации рибосом. Для снятия с колонки 60S субъединиц оказывается достаточным повысить температуру элюента до 35° — субъединицы выходят четким пиком [К. Man hester, J. Man hester, 1980]. [c.179]

Процедура активации состоит в следующем. 100 мл набухшей сефарозы промывают на бюхнеровской воронке 3—4 объемами деионизованной воды и суспендируют с медленным перемешиванием (как. в предыдущем методе) в 50—70 мл воды. Добавляют 10 мл бмс-окси-рана и 30 мл 2 М раствора NaOH, содержащего 0,2 г NaBH . Суспензию перемешивают в течение ночи при комнатной температуре под тягой, затем гель тщательно промывают деионизованной водой п переносят в колбу с буфером для посадки лиганда. Другие авторы рекомендуют несколько иное соотношение тех же реагентов [Uy, Wold, 1977]. [c.351]

Аффинную очистку метилаз вели на сорбенте, полученном иммобилизацией SAH на сефарозе. Исходной матрицей служила AH-Sepharose 4В . Спейсер активировали присоединением остатка бромуксусной кислоты в] реакции с О-бром-ацетил-К-оксисукцинимидом. SAH фиксировали инкубацией с суспензией активированного сорбента в течение 3 сут при комнатной температуре. Частично очищенный фермент сорбировали на ВАН-сефарозе в 0,005 М Na-фос-фатном буфере (pH 6,2) с 5 мМ ЭДТА и 2,4 мМ -меркаптоэтанола. Биоспецифи-ческую элюцию вели раствором субстрата — 0,02 мМ SAM в том же буфере. [c.432]

Суммарную ядерную РНК растворяли в 0,5—1 мл 0,01 М Na-ацетатного буфера (pH 6), содержащего 0,5% ДДС-Na, и прогревали 5 мин при 100° для разрушения агрегатов и диссоциации возможных двунитевых структур РНК и остаточных РНК—ДНК-гибридов. Затем раствор вносили на термостатированную при 50° колонку тиопропил-сефарозы 6В размером 5 х 1 см, уравновешенную тем же раствором, и выдерживали при этой температуре 30 мин. Повышенная температура (но не выше 50° ) увеличивает эффективность связывания на сорбенте новосинтезированной меркурированной РНК. Затем температуру снижали до 20° и промывали колонку последовательно избытком того же буфера, водой, 50%-ным водным раствором диметилсульфоксида (ДМСО) и снова водой. Отмечено, что промывка ДМСО существенно улучшала избирательность связывания Hg-PHK. Элюцию последней вели 50 мМ раствором -меркаптоэтанола в 0,01 М Na-ацетатном буфере (pH 6). Для отбора фракций, содержащих РНК, ее в ходе синтеза одновременно с меркурированием метили тритием с помощью H-UTP. [c.437]

В спектрофотометрическую кювету с длиной оптического пути 1 см вносят 0,1 мл суспензии иммобилизованного на сефарозе белка, добавляют 2 мл раствора кумасси, перемешивают при комнатной температуре 2—3 мин и быстро измеряют оптическую плотность смеси при 595 нм, используя в качестве контроля кювету, содержащую 0,1 мл суспензии неактивированной сефарозы и 2 мл красителя. Для построения калибровочного графика к 0,1 мл суспензии неактивированной се-<фарозЫ добавляют от 2 до 20 мкг исходного препарата белка и 2 мл раствора красителя, а затем измеряют оптическую плотность. С помощью данного метода можно определить содержание белка в препаратах иммобилизованных ферментов, содержащих более 10 мкг белка в [c.85]

К активированной сефарозе добавляют равный объем раствора фермента (1 мл на 1 г сефарозы) и инкубируют при комнатной температуре в течение 2,5—3,0 ч при перемешивании. К суспензии добавляют сухой глицин до конечной концентрации 50 мМ и оставляют при перемещивании в холодной комнате на ночь. Сефарозу отмывают в колонке или на стеклянном фильтре буфером А от неспецифически адсорбировавшегося белка и глицина до исчезновения в элюате поглощения при 280 нм и прекращения активности фермента. [c.298]

Препараты сефарозы с глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназой, иммобилизованной при разной степени активации, помещают в колонки (размер 0,5x3 см) и уравновешивают 0,15 М раствором Na I. Затем при комнатной температуре через колонки пропускают антисыворотку до полного насыщения иммуносорбента антителами (т. е. до прекращения адсорбции антител на сорбенте при пропускании дополнительных порций антисыворотки). Иммуносорбент отмывают от балластных белков 0,15 М раствором Na l до исчезновения поглощения при длине волны 280 нм в элюате. [c.304]

Приготовление иммуносорбента. Br N-активированную сефарозу (I г) обрабатывают, как обычно (с. 297). Полученный гель (3,5 мл) быстро промывают бикарбонатным буфером (pH 8,3) и вносят в раствор антител (20 мг антител в 10 мл бикарбонатного буфера). Инкубируют 2 ч при комнатной температуре, осторожно перемешивая механической мешалкой. Гель промывают в 100 мл того же буфера и переносят для блокирования оставшихся активных групп матрицы в 20 мл глицинового буфера 0,2 М, pH 8. Инкубируют 2 ч при комнатной температуре, постоянно осторожно перемешивая механической мешалкой. На воронке гель отмывают от несвязавшихся иммуноглобулинов и глицина бикарбонатным буфером (pH 8,3), затем ацетатным буфером, pH 4. Цикл повторяют, затем отмывают фосфатным буфером и хранят в нем при 4 С. [c.325]

Сефароза (фирма Pharma ia). Носители на основе гелей агарозы, содержащие очень мало заряженных групп. Интервал фракционирования определяется концентрацией агарозы в гранулах. Устойчив в водных растворах при pH 4 — 9. Может быть использован в растворах, содержащих высокие концентрации солей, мочевины, гуанидингидрохлорида, хотя в условиях, способствующих сильной диссоциации, предпочтительнее использовать сефарозу L. Разрушается под действием окислителей. Плавится при нагревании не следует использовать при температуре > 40°С. Можно стерилизовать химическим способом, например путем обработки диэтилпиро-карбонатом, но не путем автоклавирования. Не замораживать замораживание разрушает структуру зерен. [c.442]

Сефароза L-это носитель на основе поперечно-сшитого агарозного геля, получаемый в результате обработки соответствующего типа сефарозы 2,3-дибромпропаном. Поперечное сшивание повышает химическую, термическую и механическую стабильность. Устойчив при pH 3 -н 14, в 8 М мочевине, 6 М гуанидингидрохлориде, 3 М KS N. Можно использовать во многих органических растворителях и при температурах < 70°С устойчив к автоклавированию при 120°С и pH 7. Разрушается в присутствии окислителей. [c.442]

Иммобилизация нуклеиновых кислот и олигонуклеотидов позволяет получить сорбенты, способные селективно связывать определенные нуклеиновые кислоты, обладающие комплементарными последовательностями, или белки, обладающие сродством к нуклеиновым кислотам — к молекуле целиком либо ее части. Например, олиго ((1Т)-сефароза широко используется для извлечения эукариотических мРНК из смеси нуклеиновых кислот, так как они имеют поли(А)хвосты на 3 -конце полинуклеотидной цепи. После образования комплементарных комплексов с иммобилизованным олиго((1Т) и отделения всех других компонентов смеси эти мРНК могут быть легко элюированы после повышения температуры %ыше точки плавления соответствующего дуплекса. [c.247]

Рис. 5.4. Аффинная хроматография а-химотрипсина на колонках сефарозы с ингибитором [5]. Колонки (50X5 мм) предварительно уравновешивались 0,05 М трис-Н1 1-6у- ером (pH 8,0). Образец (2,5 мг) наносился в и,з мл того л с буферного рас твора. Колонки элюировались при комнатной температуре, скорость потока 40 мл/ч объем фракции 1 мл. Стрелки указывают замену элюента на 0,1 М уксусную кислоту (pH 3,0).

Связывание лактатдегидрогеназы на №-(6-аминогексил)-б -АМР — сефарозе настолько сильно, что фермент нельзя элюировать даже 1 М КС1 при 40 °С. Однако для элюирования можно использовать линейный градиент концентрации NADH. На рис. 5.12 показан график зависимости концентрации NADH, необходимой для элюирования лактатдегидрогеназы, от температуры. С повышением температуры необходимая концентрация специфического элюирующего агента уменьшается, что отражается линейным графиком Аррениуса. Соответствующая энергия адсорбции составляет 54,6 кДж/моль (13,0 ккал/моль) [9]. [c.87]

На рис. 5.13 показано влияние температуры на связываемость р ферментов термофильного микроорганизма —- алкогольдегидрогеназы и фосфофруктокиназы из ВассШиз stearothermophilus — на №-(6-аминогексил)-5 -АМР —сефарозе [2]. Для упомянутых ферментов термофила связываемость р, напротив, первоначально [c.88]

Рис. 5.12. Связываемость 5 лактатдегидрогеназы из мышцы сердца свиньи на К -(6-аминогекснл)-5 -АМР—сефарозе в зависимости от температуры [9].

Рис. 5.13. Влияние температуры на связываемость р алкогольдегидрогеназы 1) и фосфофруктокиназы 2) на N -(6-аминогексил)-5 -АМР—сефарозе [2]. Проводился диализ экстракта фермента (0,5 мл), содержащего 81 Е фосфофруктокиназы, 20 Е или 18,7 мг/мл алкогольдегидрогеназы, против 10 мМ К-фосфатиого буферного раствора (pH 6,8) затем раствор пропускался через колонку с замещенной АМР—сефарозой. Элюирование осуществлялось в линейном градиенте концентрации (0—1 моль/л) КС1 (общий объем элюата 40 мл) в 10 мМ К-фосфатном буфере скорость потока 0,4 мл/мин.

Рис. 5.14. Зависимость связываемости 3 алкогольдегидрогеназы (а) и фосфофруктокиназы (б) на №-(6-аминогексил)-5 -АМР—сефарозе от pH и связь кажущихся р/С (абсцисса в точках перегиба на рис, а и б) и температур связывания алкогольдегидрогеназы 1) и фосфофруктокиназы (2) (в) [2]. Условия см. в подписи к рис. 5.13 10 мМ трис-фосфат доводился до требуемого pH при соответствующей температуре.

Для хроматографии рибосомальной РНК и для выделения плазминогена ]1роизводится лизин—сефароза 4В путем связывания ь-лизина с сефарозой 4В после активации бромцианом. Концентрация связанного лизина составляет 4—5 мкмоль на 1 мл набухшего геля. Лизин—сефароза 4В поставляется в виде лио-филизованного норощка пакетах по 15 г, что эквивалентно 60 мл набухшего геля. Порошок содержит добавки для сохранения способности геля к набуханию. При хранении сухого геля при температурах <8°С не наблюдается никакой заметной потери связанного лиганда даже через 1 год хранения. [c.141]

Ряд алкилагароз со структурой СНз(СН2)пМН—сефароза (где п принимает значения от О до 7), и-аминоалкилагароз со структурой ЫН2(СН2)п ЫН—сефароза (где п — от 2 до 8) характеризуется близким содержанием алкильных боковых цепей на гранулу геля [15, 49]. В одинаковых условиях (pH, ионная сила, состав буферного раствора и температура) способность СНз(СН2)пЫН—сефарозы удерживать фосфорилазу Ь зависит от длины углеводородных цепей. При хроматографии на производных сефарозы (я = 0 или 1) фосфорилаза Ь выходила из колонки с фронтом растворителя при п = 2 происходила задержка фермента, а при п = 3 фермент адсорбировался. Элюирование фосфорилазы Ь с модифицированной сефарозы (п = 3) возможно с помощью деформирующих буферных растворов, которые, как было показано, приводят к обратимым структурным изменениям фермента. На производном сефарозы с л = 5 связывание фосфорилазы было настолько сильным, что фермент не элюировался с колонки, даже когда pH деформирующего буферного раствора понижался до 5,8, хотя деформирующая способность такого буфера намного выше. Освободить фосфорилазу Ь из комплекса с этим производным можно только в неактивной форме после промывки колонки 0,2 М уксусной кислотой. Сама агароза содержит отрицательные заряды, а связывание алкил- или ариламинов на активированной бромцианом агарозе вводит в гель положительные заряды (разд. 8.2.4). В связи с этим йост и др. [28] обращали внимание на то, что на сефарозе с алкиламинами, прикрепленными после предварительной активации носителя бромцианом, связывание белков происходит большей частью при pH выше изоэлектрической точки выделяемых белков. Поэтому допускалось, что в этих случаях электростатические взаимодействия с положительно заряженной Ы-замещенной изомочевиной более существенны для связывания, чем гидрофобные взаимодействия с гидрофобной боковой цепью. Тем не менее гранулы агарозы не связывают фосфорилазу Ь, пока к ним не будут прикреплены алкильные боковые цепи некоторой минимальной длины. Кроме того, отмеченные выше заряды в равной мере присутствуют во всех членах гомологического ряда, и, следовательно, они не могут быть причиной различий в степени [c.152]

О стабильности агарозы известно, что она устойчива в области pH 4—9 не рекомендуются температуры ниже 0°С и выше 40 °С. Сефароза устойчива к высоким концентрациям солей, мочевине (7 моль/л) и гуавидинхлориду (6 моль/л) [12]. Она не [c.186]

Требуемое количество геля замачивают для набухания в 10 М соляной кислоте 10 М соляную кислоту используют также для промывки геля в течение 15 мин. 1 г лиофильно высушенного геля набухает до объема 3,5 мл. Гель рекомендуется промывать в несколько приемов, используя на 1 г сухого геля 200 мл раствора. Сразу же после промывки добавляют раствор аффинного лиганда, который необходимо привязать к сефарозе. Оптимальные условия для связывания аффинного лнганда (pH, состав буфера и температура) зависят до определенной степени от характера лиганда. Как правило, реакция связывания наиболее эффективна при pH 8—10, но можно использовать и более низкие значения pH, если этого требует природа связываемого лигапда. Аффинный лиганд присоединяется в достаточных количествах даже и при этих pH, если увеличить количество бро.мциана при активации и количество лиганда при связывании. Аффинный ли1анд, в особенности белкового характера, растворяют в буфере с высокой ионной силой (около 0,5) для предотвращения неспецифической адсорбции. Высокая ионная сила облегчает затем последующую промывку.. Можно использовать карбонатный и боратный буферы с добавка.ми хлорида натрия. [c.190]

Количество связанного аффинного лиганда зависит от содержания его в реакиионн.ой смеси и объема геля, pH реакции, природы присоединяемого лиганда (числа реакционных групп и т. п.), а также от времени реакции и температуры. Например, при присоединении химотрипсина к 2 мл активированной бромцианом сефарозы при pH 8 из 10 мг присутствующего белка присоединяется только 5 мг, из 20 мг— 8 мг, а нз 30 мг— 10 мг. При комнатной температуре (20—25 °С) присоединение обычно заканчивается за 2 ч, в то время как при более низких температурах рекомендуется оставлять реакционную смесь на ночь. Реакционную смесь следует перемешивать, однако не рекомендуется использовать магнитную мешалку, так как это может привести к механической деструкции геля. [c.190]

Когда связывание аффинного лиганда на нерастворимом носителе закончено, рекомендуется удалить остающиеся активные группы, чтобы исключить дальнейшее связывание. Если аффинный лиганд связывается своими аминогруппами, в качестве инактивирующих агентов наиболее часто используются низкомолекулярные первичные амины. Например, согласно рекомендациям фирмы РЬагтас1а, при связывании на сефарозе, активированной бромцианом, инактивация остающихся активных групп может быть достигнута достаточно просто при взаимодействии с 1 М 2-ами-но этанолом при pH 9 и комнатной температуре в течение 2 ч, в то же время после связывания на эпоксиактивированной сефарозе для инактивации в тех же условиях требуется 4 ч. Используется тот же буфер, что и при связывании, например 0,1 М. бикарбонат натрия, содержащий 0,5 моль/л хлорида натрия. Для бло- [c.216]

Смотреть страницы где упоминается термин Сефароза температуры: [c.119] [c.177] [c.177] [c.178] [c.353] [c.378] [c.379] [c.389] [c.389] [c.438] [c.443] [c.444] [c.444] [c.445] [c.25] [c.86] [c.94] [c.142] [c.157] [c.160] [c.190] [c.195] [c.213]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология